[發(fā)明專利]快速檢測結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白的免疫層析試紙及其制法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110371614.7
• 申請日: 2011-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN102426244A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐寧;姚航平
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于臨床微生物快速檢測的免疫層析技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用抗ESAT-6蛋白抗體相關(guān)的免疫層析顯色來早期鑒定培養(yǎng)物中結(jié)核分枝桿菌的方法。

背景技術(shù)

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球已有近1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80％，其中約5％-10％攜帶者可發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。我國結(jié)核病人數(shù)居全球第二位，每年死于結(jié)核病的人是各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍多。近二十年由于艾滋病的流行，感染了人類免疫缺陷病毒(HIV)的結(jié)核分枝桿菌攜帶者發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的可能性比未感染HIV者高30-50倍。結(jié)核病又成為了威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題，更是影響我國發(fā)展的重大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問題。提高結(jié)核病及HIV合并結(jié)核感染的早期準(zhǔn)確診斷水平，發(fā)展一種適合我國國情的快速、靈敏便宜的結(jié)核分枝桿菌早期檢出方法刻不容緩。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)分離是目前結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)菌的遺傳特性決定了其生長周期特別長，使用普通羅氏培養(yǎng)基需要4-8周時(shí)間，改良酸性羅-瓊氏培養(yǎng)平均也需要25天，無法充分滿足臨床快速診斷的需要。針對結(jié)核分枝桿菌的快速培養(yǎng)，目前出現(xiàn)了各種改良的液體培養(yǎng)基和自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)(馬俊，王自立.結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)的研究進(jìn)展及其臨床意義[J]中國脊柱脊髓雜志，2007，17(5).388-390)。液體變色培養(yǎng)基最先由德國Heipha/Biotest公司研制，稱為MB?Redox系統(tǒng)，目前國內(nèi)也有類似產(chǎn)品的研發(fā)。自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)包括以Bactec?MGIT?960為代表的第二代分枝桿菌快速培養(yǎng)、藥敏檢測系統(tǒng)以及BBLMGIT分枝桿菌快速手工培養(yǎng)、鑒定、藥敏檢測系統(tǒng)等。不管是液體培養(yǎng)基還是自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)，都還存在污染率高的問題，對于儀器判斷為陽性的樣品，仍須進(jìn)行涂片、抗酸染色、顯微鏡下找到抗酸桿菌后方能判定陽性，費(fèi)事費(fèi)力。自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)更由于儀器和試劑價(jià)格昂貴，難以得到普及。因此研究開發(fā)新一代結(jié)核分枝桿菌的快速檢測試劑非常必要。

結(jié)核分枝桿菌6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)是從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中分離純化出的一種低分子量分泌性蛋白。它具有良好的免疫原性，且僅存在于致病性分枝桿菌中，包括人型結(jié)核桿菌、牛型結(jié)核桿菌、非洲分枝桿菌以及蘇爾加分枝桿菌、海水分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等非典型分枝桿菌，而不存在于BCG及其他非致病性分枝桿菌(Harboe?M.Evidence?for?occurrence?of?the?ESAT-6?protein?in?Mycobacterium?tuberculosis?and?virulent?Mycobacterium?bovis?and?for?its?absence?in?Mycobacterium?bovis?BCG[J].Infection?and?Immunity，1996，64(1)：16-22.)，因此在診斷結(jié)核桿菌感染的過程中可以區(qū)別是結(jié)核分枝桿菌感染還是非致病性結(jié)核分支桿菌感染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種使用簡便快捷、靈敏度和特異性高、適合于基層現(xiàn)場快速檢測培養(yǎng)物中結(jié)核分枝桿菌的免疫層析試紙。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種快速檢測結(jié)核分枝桿菌的免疫層析試紙，包括上樣墊、含有金標(biāo)記的抗ESAT-6單克隆抗體TBEA8的膠體金墊、包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜、吸樣墊以及支撐板；檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3，質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG抗體；在硝酸纖維素膜的上表面分別設(shè)置膠體金墊和吸樣墊，上樣墊位于膠體金墊的上表面，硝酸纖維素膜的下表面與支撐板固定相連。

本發(fā)明還同時(shí)提供了上述快速檢測結(jié)核分枝桿菌的免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟：

A、抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3和TBEA8的制備：

用于包被檢測線的抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3，其能特異性識(shí)別ESAT-6的aa?1-14MTEQQWNFAGIEAA抗原肽序列，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C201080；

用于膠體金墊中金標(biāo)記的抗ESAT-6單克隆抗體TBEA8，其能特異性識(shí)別ESAT-6的aa?24-36?SIHSLLDEGKQSL抗原肽序列，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C201081；

制備方法如下：