[發明專利]快速檢測結核分枝桿菌分泌蛋白的免疫層析試紙及其制法

有效

• 申請號: 201110371614.7
• 申請日: 2011-11-21
• 公開（公告）號: CN102426244A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 徐寧;姚航平
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙，其特征是：包括上樣墊(1)、含有金標記的抗ESAT-6單克隆抗體TBEA8的膠體金墊(2)、包被質控線(3)和檢測線(6)的硝酸纖維素膜(5)、吸樣墊(4)以及支撐板(7)；所述檢測線(6)為包被在硝酸纖維素膜(5)上的抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3，所述質控線(3)為包被在硝酸纖維素膜(5)上的羊抗鼠IgG抗體；在硝酸纖維素膜(5)的上表面分別設置膠體金墊(2)和吸樣墊(4)，上樣墊(4)位于膠體金墊(2)的上表面，硝酸纖維素膜(5)的下表面與支撐板(7)固定相連。

2.如權利要求1所述的快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙的制備方法，其特征是包括以下步驟：

A、抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3和TBEA8的制備：

用于包被檢測線(6)的抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO：C201080；

用于膠體金墊(2)中金標記的抗ESAT-6單克隆抗體TBEA8，由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO：C201081；

制備方法如下：

1)、單抗腹水的誘導：在接種雜交瘤細胞前一周，給BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接種5×10⁶能產生TBEF3或TBEA8的陽性雜交瘤細胞，10天后收集腹水離心；

2)、TBEF3或TBEA8單克隆抗體的純化：利用Protein?G親和純化法分別純化腹水中的TBEF3或TBEA8單克隆抗體；

B、制作包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)；然后將包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)粘貼在支撐板(7)上；

所述包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)的制作方法依次進行如下步驟：

1)、用0.01mol/L?PH7.4磷酸鹽PBS緩沖液將抗ESAT-6單克隆抗體TBEF3配制成濃度為0.45～0.55mg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜(5)的下表面以0.8～1.2ul/cm的參數劃線，包被成檢測線(6)；

2)、用0.01mol/L?PH7.4磷酸鹽PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體配制成0.45～0.55mg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜(5)的上表面以0.8～1.2ul/cm的參數劃線，包被成質控線(3)；

3)、將劃線后的硝酸纖維素膜(5)于36.5～37.5℃的溫度和小于30％的相對濕度的條件下干燥8～10小時；得包被檢測線(6)和質控線(3)的硝酸纖維素膜(5)；

C、制備含有金標記的抗ESAT-6單克隆抗體TBEA8的膠體金墊(2)：

將TBEA8單克隆抗體膠體金探針溶液加入玻璃纖維膜或聚酯纖維膜，干燥后，得膠體金墊(2)；將膠體金墊(2)粘貼在步驟B得到的硝酸纖維素膜(5)的上表面的左側；

所述TBEA8單克隆抗體膠體金探針溶液的制備方法如下：

1)、將質量濃度0.01％的HAuCL₄水溶液加熱煮沸，每50ml?HAuCL₄水溶液在磁力加熱攪拌下加入1.7～1.8ml的質量濃度1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱攪拌8～12分鐘；得膠體金溶液；

2)、調節膠體金溶液至pH7.0，將抗體TBEA8按0.85～0.95mg抗體TBEA8/100ml膠體金溶液的比例偶聯，混勻后為TBEA8的免疫膠體金探針溶液；

3)、將上述TBEA8的免疫膠體金探針溶液離心后棄去上清，以重懸液重懸沉淀物，得TBEA8單克隆抗體膠體金探針溶液；所述重懸液是步驟2)所用膠體金溶液體積的3/8～5/8；

所述重懸液的制備方法如下：在每L?0.01mol/L?pH7.4的PBS緩沖液中加入9～11g的BSA、48～52g的蔗糖、0.28～0.32g的PEG20000制備而得；

D、在步驟C所得的膠體金墊(2)的上表面粘貼上樣墊(1)；在硝酸纖維素膜(5)的上表面的右側搭接吸樣墊(4)；得快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙。

3.如權利要求2所述的快速檢測結核分枝桿菌的免疫層析試紙的制備方法，其特征是：所述步驟C中：將TBEA8單克隆抗體膠體金探針溶液按1ml溶液鋪23～27cm²的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或聚酯纖維膜上。