[發明專利]一種3-羥基丙酸高產菌株及其應用

有效

• 申請號: 201110371603.9
• 申請日: 2011-11-21
• 公開（公告）號: CN102382778A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 諸葛斌;范俊英;方慧英;諸葛健
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12P7/42;C12R1/72
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域：

本發明涉及一種3-羥基丙酸高產菌株及其應用，尤其是一種是經物理化學復合誘變得到的酵母菌Candida?sp.及其應用于轉化丙酸為3-羥基丙酸。

背景技術：

3-羥基丙酸(3-Hydroxypropionic?acid；又稱β-Hydroxypropionic?acid；縮寫為3-HP；分子式C₃H₆O₃；CAS號503-66-2；pK4.51；分子量90；密度1.08)是一個三碳無手性有機酸，與乳酸互為同分異構體。3-HP具有羥基和羧基兩個官能團，是很多光學活性物質的前體。它脫水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，還原生成1，3-丙二醇，聚合生成高分子材料，是一種重要的化工平臺產品。2004年美國能源部將其列為當今世界12種最具潛力的化工產品之一。

目前，3-HP的生產方法是化學合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯腈轉化法。但在碳末端引入功能團有很大的難度，且其產品不易分離提純，生產成本較高，生產過程存在不安全因素，而微生物發酵方法生產3-HP可以有效的避免這些不利因素。微生物轉化法生產3-HP的研究始于上世紀60年代但一直處于實驗室階段。主要包括構建基因工程菌法和野生菌發酵法。基因工程法生產3-HP主要有兩條途徑：以葡萄糖為底物和以甘油為底物的生物轉化路線。目前，已知的可發酵產3-HP的野生菌株主要有：Hansenula?miso；Fusarium?merismoides；Candida?rugosa；Byssochlamys?sp.；Rhodococcus?erythropolis?LG12；Klebsiella?terrigena。

發明內容：

本發明要解決的技術問題是提供一種3-羥基丙酸高產菌株，為假絲酵母變種(Candida?sp.)，通過紫外-亞硝基胍-鈷60復合誘變獲得，于2011年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏委員會管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.5344，其催化丙酸轉化為3-羥基丙酸的能力增強，同時，耐受丙酸的性能增強。

本發明要解決的另一個技術問題是提供一種應用所述菌株轉化丙酸為3-羥基丙酸的方法，菌株經過種子培養活化后，以4-10％接種量接種發酵培養基，在28-32℃下發酵培養96h得到含有3-羥基丙酸的發酵液。

為提高3-羥基丙酸的產率，控制發酵培養基pH為6.5，不限于在發酵培養基中加入濃度為10-30％(V/V)，pH為6.5的磷酸鹽緩沖液；優選20％(V/V)的磷酸鹽緩沖液(6.5)。

為了進一步提高3-羥基丙酸的產率，對發酵過程進行優化，發酵24小時后，流加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液控制發酵過程中葡萄糖濃度在15-25g/L；其中優選的添加為發酵48-84h內補加含有葡萄糖/甘油的緩沖液或葡萄糖/甘油水溶液以維持發酵過程中葡萄糖濃度在20g/L。

此外，發酵24小時后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液控制發酵過程中丙酸濃度為10-20g/L；其中優選的添加為在發酵48h后，流加丙酸-氫氧化鈉-氫氧化鉀-氫氧化銨(8∶1∶1∶1)或丙酸溶液以維持發酵過程中丙酸濃度為15g/L。

3-羥基丙酸的測定方法：高效液相色譜法，色譜柱：Ecosile?C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：3％甲醇，用H₃PO₄調pH至2.0；檢測條件：紫外檢測器，柱溫35℃，流速0.8mL/min，進樣量20μL。

本發明提供的3-羥基丙酸產量較高的突變菌株，其產量高且遺傳性狀穩定。此外，本發明還提供了一種該菌株以丙酸為底物生物轉化3-羥基丙酸的方法，利用此方法3-羥基丙酸的產量達到23g/L，具有廣闊的前景。

具體實施方式：

實施例1新菌株CGMCC?No.5344的獲得

(a)將野生菌Candida?sp.CCTCC?NO：M?93018用含有丙酸的培養基馴化，挑選得到的出發菌株a；

(b)將出發菌株a經紫外-亞硝基胍-鈷60復合誘變，得到混合種子液b；

(c)將b涂布完全培養，得到單菌落點種篩選培養基；

(d)培養篩選單菌落，發酵檢測驗證，得到誘變高產株CGMCC?No.5344。

步驟(a)中丙酸馴化的濃度為0.5％-3％。