[發(fā)明專利]一種可視的多個基因突變位點同時檢測的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110369994.0
• 申請日: 2011-11-18
• 公開（公告）號: CN102382892A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王樹;楊瓊;宋金召
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可視的多個基因突變位點同時檢測的方法。

背景技術(shù)

基因突變是由于DNA分子中發(fā)生堿基對的插入、缺失或改變，而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變。

近年來，對癌癥病人進行個性化治療已經(jīng)成為一種趨勢，它是根據(jù)癌癥患者藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)特點，采用特異和最佳的化療藥物方案進行治療的方法。目前，基因突變分析已經(jīng)使癌癥患者個性化治療成為可能，用基因突變分析可以為醫(yī)生提供有力的證據(jù)和信息，在實施治療方案時，可選擇對患者最有效的藥物治療方案，不僅提高了療效，還可以降低化療的毒副作用，同時提高患者的生存質(zhì)量。

另外，人體內(nèi)一些基因型的存在會增加人類患某種疾病的風(fēng)險，這種基因就叫疾病易感基因。通過疾病易感基因突變分析，可向人們提供個性化健康指導(dǎo)服務(wù)、個性化用藥指導(dǎo)服務(wù)和個性化體檢指導(dǎo)服務(wù)。就可以在疾病發(fā)生之前的幾年、甚至幾十年進行準(zhǔn)確的預(yù)防，而不是盲目的保健；人們可以通過調(diào)整膳食營養(yǎng)、改變生活方式、增加體檢頻度、接受早期診治等多種方法，有效地規(guī)避疾病發(fā)生的環(huán)境因素。

基因突變分析方法常采用電泳分析和固相雜交的方法，如：DNA測序、限制酶切片段長度多態(tài)性分析、單鏈DNA構(gòu)象多態(tài)性分析、異源雙鏈核酸分析、等位基因特異性寡聚核苷酸雜交、錯配酶切分析、寡聚核苷酸連接分析等，這些方法需要繁瑣的分離或洗滌程序，增加了檢測時間。采用均相檢測方法可以避免上述問題，目前的均相檢測方法均基于熒光偏振或小分子熒光染料之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，偏振化熒光的強度大大降低，導(dǎo)致了基于熒光偏振的方法靈敏度不高；基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法均要對探針分子進行雙修飾，導(dǎo)致成本很高。

隨著個性化醫(yī)療時代的到來，操作簡單高靈敏多基因突變位點的均相的同時分析不僅能減少檢測成本，簡化工作流程，而且還能為患者節(jié)省時間，讓醫(yī)生快速準(zhǔn)確地制定治療和預(yù)防方案。

目前一些已知的基因突變位點檢測不太靈敏，如PIK3CA基因(NM_006218)的突變位點E545K、H1047R、E542K、H1047L，BRCA1基因(NM_007294)的突變位點185delAG、5382insC，BRCA2基因(NM_000059)的突變位點6174delT；Kras基因(NM_004985)的突變位點34G＞A、38G＞A、35G＞A，BRAF基因(NM_004333)的突變位點V600E，因此研究一種可以檢測這些位點的方法可以為醫(yī)生快速準(zhǔn)確地制定治療和預(yù)防方案奠定基礎(chǔ)。

E542K為PIK3CA基因所編碼蛋白的第542位E突變?yōu)镵，PIK3CA基因的第1624位核苷酸G突變?yōu)锳。E545K為PIK3CA基因所編碼蛋白的第545位E突變?yōu)镵，PIK3CA基因的第1633位核苷酸G突變?yōu)锳。H1047R為PIK3CA基因所編碼蛋白的第1047位H突變?yōu)镽，PIK3CA基因的第3140位核苷酸A突變?yōu)镚。H1047L為PIK3CA基因所編碼蛋白的第1047位H突變?yōu)長，PIK3CA基因的第3140位核苷酸A突變?yōu)門。34G＞A為Kras基因的第34位核苷酸G突變?yōu)锳。35G＞A為Kras基因的第35位核苷酸G突變?yōu)锳。38G＞A為Kras基因的第38位核苷酸G突變?yōu)锳。V600E為BRAF基因所編碼蛋白的第600位V突變?yōu)镋，BRAF基因的第1799位T核苷酸突變?yōu)锳。185delAG為BRCA1基因的第185位缺失了AG。5382insC為BRCA1基因的第5382位插入了C。6174delT為BRCA2基因的第6174位缺失了T。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測DNA中突變位點的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括以下步驟：

1)以待測DNA為模板進行多重PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，

2)用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)得到的PCR擴增產(chǎn)物，得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物；

3)將步驟2)得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與式(I)的化合物反應(yīng)，直接目測觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色確定所述待測DNA中的目標(biāo)基因的突變位點；

式(I)；

在上述式(I)中，R代表鏈端含有四級胺的直鏈或支鏈的烷基，所述烷基的主鏈長為2-12個碳，X代表鹵素；

上述式(I)化合物的數(shù)均分子量為5000-100000。

在上述方法中，步驟1)中，所述多重PCR擴增的引物為能夠擴增所述待測DNA中的目標(biāo)基因的所有突變位點的引物組；

所述引物組由若干個能擴增所述待測DNA中的目標(biāo)基因的突變位點的引物對組成；