[發(fā)明專利]一種可視的多個(gè)基因突變位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110369994.0
• 申請(qǐng)日: 2011-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102382892A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王樹(shù);楊瓊;宋金召
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

1.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)DNA中突變位點(diǎn)的方法，包括以下步驟：

1)以待測(cè)DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，

2)用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物；

3)將步驟2)得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與式(I)的化合物反應(yīng)，直接目測(cè)觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色確定所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)；

式(I)；

式(I)中，R代表鏈端含有四級(jí)胺的直鏈或支鏈的烷基，所述烷基的主鏈長(zhǎng)為2-12個(gè)碳，X代表鹵素；

所述式(I)化合物的數(shù)均分子量為5000-100000。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為：

步驟1)中，所述多重PCR擴(kuò)增的引物為能夠擴(kuò)增所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的所有突變位點(diǎn)的引物組；所述引物組由若干個(gè)能擴(kuò)增所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)的引物對(duì)組成；

步驟2)中，所述用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括如下步驟：

向步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入突變型特異性引物和與所述突變型特異性引物對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物；

所述突變型特異性引物與所述突變位點(diǎn)相鄰20-25bp的序列互補(bǔ)，且所述突變型特異性引物的3′末端核苷酸與所述突變位點(diǎn)的突變型核苷酸互補(bǔ)；

所述突變型特異性引物對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP與所述突變位點(diǎn)相鄰的堿基互補(bǔ)；所述突變位點(diǎn)相鄰的堿基為位于所述突變型特異性引物延伸方向下游的一個(gè)堿基；

每一條所述突變型特異性引物及其對(duì)應(yīng)的所述熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP對(duì)應(yīng)一個(gè)突變位點(diǎn)；

所述突變型特異引物的條數(shù)和所述熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的個(gè)數(shù)均與所述目標(biāo)基因中的突變位點(diǎn)的個(gè)數(shù)相同；

每一個(gè)所述熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的熒光物質(zhì)的熒光顏色不同；

步驟3)中，所述將步驟2)得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與上述式(I)的化合物反應(yīng)包括如下步驟：將步驟2)得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與上述式(I)的化合物混勻，得到反應(yīng)產(chǎn)物；

所述觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色確定所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)為：

若反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的熒光物質(zhì)顏色相同，則所述待測(cè)DNA的目標(biāo)基因含有或候選含有與所述dNTP或ddNTP互補(bǔ)的堿基相鄰的突變位點(diǎn)；若反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的熒光物質(zhì)顏色不同，則所述待測(cè)DNA的目標(biāo)基因不含有或候選不含有與所述dNTP或ddNTP互補(bǔ)的堿基相鄰的突變位點(diǎn)；

所述熒光物質(zhì)具體為熒光素、德克薩斯紅或Cy3。