[發明專利]一種利用PCR-RFLP技術鑒別西花薊馬品系的方法

無效

• 申請號: 201110366091.7
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102392075A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 于毅;褚棟;段惠生;張安盛;國棟
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙龍群

技術領域

本發明涉及一種利用PCR-RFLP技術鑒別西花薊馬品系的方法，屬于農業生物技術領域。

背景技術

西花薊馬(Frankliniella?occidentalis)，其屬于纓翅目(Thysanoptera)薊馬科(Thripidae)花薊馬屬(Frankliniella)，最初起源于美國西部，20世紀80年代開始迅速擴散至全球各大洲，目前已在69個國家和地區有報道，是當今世上對作物危害最嚴重的世界性害蟲之一(Kirk，2001；Kirk?and?Terry，2003)。該害蟲不僅取食寄主植物汁液，在果實表明形成傷痕，降低果品質量，而且能以持久性的方式傳播番茄斑萎病毒病(TSWV)和鳳仙花壞死斑病毒(INSV)(Kritzman?A，2002)。并且，傳播的病毒所造成的經濟損失遠遠大于其本身所造成的損失。我國農業部于1996年將其列為進境地植物檢疫潛在性害蟲。

Brunner等(2010)基于mtCOI基因序列發現世界各地西花薊馬種群存在2個遺傳支系，并建議將這2個遺傳支系定義為2個生態型(ecotypes)，而Rugman-Jones等(2010)建議將其定義為2個種。為了論述方便，本專利文件中分別將其稱為G型和L型。資料表明，G型和L型西花薊馬在產卵量、寄主適應性、生境適應性、抗藥性等生物學方面存在差異(deKogel?et?al.，1997；Brdsgaard，1994；Brunner?et?al.，2010；Rugman-Jones?et?al.，2010)。因此準確區分兩種類型，對于進一步研究其入侵機制和生物學具有重要的理論意義與參考價值。目前，兩種類型西花薊馬從形態學上無法明確的區分，僅可以從分子遺傳學角度區分。Rugman-Jones等(2010)基于rDNA?28s設計了一組引物，通過PCR擴增，檢測PCR產物的多態性來區分兩種類型。此方法區分了美國原產地兩種類型的西花薊馬。

PCR-RFLP(限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應)技術，又稱為CAPS技術(Cleaved?Amplilfed?Polymorphism?Sequences)，它實質上是PCR技術與RFLP技術結合的一種方法。它的基本原理是先利用已知位點的DNA序列資源(基因數據庫、基因組或cDNA克隆及克隆的RAPD條帶等)設計一套特異性的PCR引物(19～27bp)，然后用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進行RFLP分析。該技術揭示的是特異PCR片段的限制性長度變異的信息。PCR-RFLP是一類共顯性分子標記，其優點是避免了RFLP分析中膜轉印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度-能夠揭示單個堿基的差異。另外，由于很多限制性內切酶均可與DNA擴增片段酶切，所以檢測到多態性機會較大(趙淑清，2000)。

PCR-RFLP技術已經廣泛應用于植物、動物、微生物以及昆蟲的物種檢測與鑒定、遺傳分化鑒定等方面(王孝宣，2003；張婷，2005；馬玉紅，2006；滕齊輝，2006)。利用該技術已區分和鑒定出了西花薊馬、美棘薊馬、煙薊馬和棕櫚薊馬等物種(Moritz，2000；Brunner，2002；Toda?and?Komazaki，2002)。PCR-RFLP技術同樣適用于物種以下介元的區分。周建峰等(2003)運用PCR-RFLP方法分析了3個亞種線粒體DNA的DNA5/6區段，利用3種內切酶，區分了3個鯉魚亞種。但利用PCR-RFLP技術構建區分西花薊馬兩個品系的方法目前還未見報道。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種利用PCR-RFLP技術鑒別西花薊馬品系的方法。

術語解釋：

G型西花薊馬：目前將組成西花薊馬入侵種主體的西花薊馬品系稱為溫室系(greenhouse?strain)，本專利文件中稱其為G型西花薊馬。

L型西花薊馬：因該品系最早發現與新西蘭的羽扇豆上，并表現出與溫室系差異明顯的生物學特性，故將其稱為羽扇豆系(lupin?strain)，本專利文件中稱其為L型西花薊馬。

一種利用PCR-RFLP技術鑒別西花薊馬品系的方法，步驟如下：

(1)提取西花薊馬基因組DNA；

(2)以西花薊馬基因組DNA為模板對其線粒體COI基因進行PCR擴增；

PCR體系中，引物序列如下：

正義引物：5’GGATCACCTGATATAGCATTCCC3’；SEQ?ID?NO.1