[發明專利]一種高通量快速提取真菌基因組DNA的方法

無效

• 申請號: 201110365304.4
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102392016A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 鄒克琴;胡東維;李素芳;王為民
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種高通量快速提取真菌基因組DNA的方法，通過這種方法可以進行各種真菌，例如酵母、霉菌、木耳、動植物病原真菌等基因組DNA的快速提取。

(二)背景技術

真菌(fungus)在自然界中分布廣泛，種屬很多。真菌的形態差異很大，有些很小必須在顯微鏡下才可以看見單細胞形態，例如酵母型菌落；有些很大肉眼可見，例如靈芝等蕈菌的子實體。真菌的營養方式為異養吸收型，即通過細胞表面自周圍環境中吸收可溶性營養物質，它可以產生大量無性和有性孢子進行繁殖。絕大多數真菌的營養體都是許多菌絲在一起的菌絲體。

真菌通常分為三類，即酵母菌、霉菌和蕈菌。它們歸屬于不同的亞門。大多數真菌屬于擔子菌亞門，少數屬于子囊菌亞門。有些真菌既是重要的菌類蔬菜，又是食品和制藥工業的重要資源。例如香菇、草菇、金針菇、平菇、木耳、銀耳、竹蓀、羊肚菌等。真菌也是重要的藥材，例如用作名貴藥材的靈芝、茯苓等。香菇、草菇等除了為人類提供蛋白質和維生素以外，同時還為人類提供真菌多糖、低聚糖等提高免疫力、抗腫瘤的生物活性物質。真菌的某些代謝產物在工業上具有廣泛用途并大規模生產，如乙醇，檸檬酸，甘油，酶制劑，甾醇，脂肪，促生素，維生素等。真菌在自然界的物質轉化中也起著不容忽視的作用。它可以將環境中的各種有機物降解為簡單的復合物和無機小分子，使許多重要化學元素得以再循環。另外，真菌還是進行基礎生物學研究的重要研究工具。但是真菌也有對人類有害的一面，寄生于動植物體表而導致動植物病害的病原真菌，動物性病原真菌?？梢鹑祟悺⒓倚蠛屠ハx類患病。許多真菌可引起人畜的疾病、植物病害、導致工業原料及農產品的霉變、食品和糧食發霉，甚至在食品和糧食中產生毒素，例如急性黃曲霉毒素中毒，會引起肝臟壞死；慢性黃曲霉毒素中毒，則會引起肝癌。這些給人類帶來了極大的危害和損失。

近幾年來，國內外對真菌的基因資源愈加重視，各國都加大了研究投資力度。在食品領域，從食用真菌基因組中挖掘和克隆一些有益基因，增加有益代謝產物的表達；在農業領域，從水稻、小麥、玉米等重要糧食作物中挖掘和克隆與寄主互作的真菌致病基因，進行抗真菌病害研究，最終獲取抗病新品種；在醫學領域，從病原真菌中找到致病基因，更好的為人類的健康提供服務。許多國家已經開始了真菌基因組DNA的功能研究，但是這些研究的前提需要提取高質量的真菌基因組DNA。由于真菌有特殊的細胞結構，有些真菌是多核細胞，富含多糖和蛋白質等次生代謝物。常規傳統方法使用了液氮研磨進行破壞細胞壁、也有用液氮結合蛋白酶K和蝸牛酶酶解破壞細胞壁等方法。真菌的核酸物質往往是和蛋白質緊密結合在一起的，而提取高質量的真菌DNA的關鍵是有效的分離核酸和蛋白質。破壞細胞膜使核酸和蛋白質解聚的方法大多使用化學試劑CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，它不但能夠解聚核酸和蛋白質，而且可以去除細胞內多糖等復雜的代謝產物。對于去除細胞破裂釋放的蛋白質，大多數使用了苯酚和β-巰基乙醇等，而這些藥品毒性很大，對人體健康有較大危害作用。目前國內外報道的這些方法消耗大量化學試劑，實驗步驟煩瑣，提取時間長，最重要的是接觸有毒試劑較多。這些都無法滿足目前高通量真菌基因組研究的需要。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種簡單安全的高通量快速提取真菌基因組DNA的方法。

本發明采用的技術方案是：

一種高通量快速提取真菌基因組DNA的方法，所述方法包括：

(1)菌絲體的裂解：從培養基上挑取真菌(包括酵母菌、霉菌和蕈菌)菌塊樣品(直徑約1～2cm)，投入改良的CTAB緩沖液(通常為100～300μL)中，用消毒過的研磨棒充分研磨菌塊；所述CTAB緩沖液組成如下：CTAB?1～5％(w/v，每100mL緩沖液中含有1～5g?CTAB)，NaCl1～2mol/L，TrisCl?50～100mmol/L，EDTA?10～50mmol/L，SDS?0.5～2％(w/v)，PVP?0.2～1％(w/v)，溶劑為去離子水；

(2)RNA雜質的去除：將研磨好的樣品補加CTAB緩沖液(通常為300～600μL，目的是使破碎的菌絲體內容物與CTAB緩沖液充分作用。)和核糖核酸酶A(RNase?A)(目的是水解RNA，對DNA不起作用，常規催化量，一般3～5μL即可，酶液濃度10～50μg/ml)，置于60～70℃水浴中，每隔5～10mins輕輕搖動，20～30mins后取出；

(3)蛋白質雜質的去除：加入氯仿∶異戊醇體積比為24∶1的CIA液，振蕩混勻1～2mins；