[發(fā)明專利]一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110365163.6
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102392080A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金鳳媚;劉仲齊;薛俊;王建江
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;A01G7/06
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及番茄黃化曲葉病毒接種鑒定的研究，更具體的說是一種快速、簡捷、高效的鑒定天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒抗性接種的方法。

背景技術(shù)

番茄黃化曲葉病毒(Tomato?yellow?leaf?curl?virus,?TYLCV)主要危害番茄、辣椒、茄子、甘藍(lán)和黃瓜等蔬菜以及煙草等經(jīng)濟(jì)作物，特別是在番茄上危害更重。針對于TYLCV病毒的發(fā)生和危害，如何準(zhǔn)確、快速、高效地檢測到該病毒的存在和發(fā)生，是蔬菜安全可持續(xù)生產(chǎn)的迫切需要。

目前，鑒定番茄黃化曲葉病抗性的方法有煙粉虱傳毒、嫁接接種和機(jī)械傳毒等等。其中，嫁接法以嫩病葉做接穗，采用腹接法接種到健康番茄上，它的優(yōu)點(diǎn)是能夠?yàn)榇b定植株提供高含量的TYLCV病毒，但該方法耗時耗力，只適于少量鑒定。機(jī)械傳播是在人工環(huán)境下把感染TYLCV的曼陀羅、心葉煙或潘那利番茄作為毒源，通過機(jī)械傳播侵染健康番茄植株，成功率較低，且病毒從番茄傳到番茄上成功的例子只有很少的報道，因此，在接種中一般不用該TYLCV病毒。在育種進(jìn)程中最常用的接種方法是煙粉虱接種鑒定法，包括溫室中煙粉虱接種、回型籠中煙粉虱接種、露地?zé)煼凼臃N3種類型，但這個方法也有一些缺點(diǎn)：1.?蟲口密度不均一對抗性鑒定的影響。若蟲口密度過大，一些抗病品種也會表現(xiàn)出感病來；若蟲口密度太小，又區(qū)分不出抗感品種。目前對蟲口密度的要求還沒有一個標(biāo)準(zhǔn)。2.蟲子逃逸引起病害的大面積發(fā)生。煙粉虱的體長一般為1-2mm，它可隨著調(diào)查人員的進(jìn)出而逃逸出來，從而給周圍番茄產(chǎn)區(qū)帶來災(zāi)害。3.受季節(jié)限制。煙粉虱的最佳活動溫度是26-28℃，低于15℃蟲子基本不活動，也就不能傳毒，這就會延緩接種鑒定的進(jìn)程。

農(nóng)桿菌接種法是近年來發(fā)展起來的一種病毒抗性鑒定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通過根癌農(nóng)桿菌侵染待鑒定植株，病毒DNA可在植物體內(nèi)形成、復(fù)制、運(yùn)輸并誘發(fā)癥狀。侵染性克隆技術(shù)首先在噬菌體病毒Qβ、脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）中獲得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist?等（1984）在雀麥花葉病毒（Brome?mosaic?virus，BMV）首次報道，至今國外已有大量的植物病毒被成功地構(gòu)建了全長cDNA?侵染性克隆（2008）。Zhang?等（2010,2009）分別構(gòu)建了番木瓜黃曲病毒的侵染性克隆和上海分離物YLCV-[CN:SH2]的侵染性克隆，證明通過農(nóng)桿菌注射能誘導(dǎo)出病毒侵染癥狀。

本發(fā)明的研究表明（2011）天津地區(qū)的分離物與上海和山東等省的分離物基因序列不同，編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的序列有2處突變，導(dǎo)致天津地區(qū)分離物與其它地區(qū)分離物氨基酸的不同，分別是90位E?到??G和104位H??到?Y，推測這兩個突變可能增強(qiáng)了其致病力。

目前，國內(nèi)還未見天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆工作的報道，因此，針對以天津?yàn)榇淼娜A北地區(qū)抗番茄曲葉病毒栽培專用品種缺乏的現(xiàn)狀，開展侵染性克隆構(gòu)建工作，建立一套方便、可靠、安全的接種新方法，為抗病育種提供一種客觀的評價體系，從而篩選培育出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的專用品種，對于提高番茄市場競爭力，推進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對傳統(tǒng)技術(shù)不能準(zhǔn)確地對TYLCV抗性進(jìn)行鑒定的問題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作，構(gòu)建了針對天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆(代號為TYLCV--TJ)，通過莖桿注射接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對該病毒的抗性。此方法無需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡單、效率高、重復(fù)性好、可控性好，能提供相對一致的接種壓力，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種簡便有效的接種鑒定方法。本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容如下：

一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

1）DNA?提?。簭氖占陌l(fā)病植株的葉片中提取基因組總DNA；

2）引物的設(shè)計(jì)：以植物總DNA為模板，設(shè)計(jì)簡并引物-對病毒DNA-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增所用PCR引物為：

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