[發明專利]一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法

有效

• 申請號: 201110365163.6
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102392080A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 金鳳媚;劉仲齊;薛俊;王建江
• 申請（專利權）人: 天津市農業生物技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;A01G7/06
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步驟進行：

1）DNA?提?。簭氖占陌l病植株的葉片中提取基因組總DNA；

2）引物的設計：以植物總DNA為模板，設計簡并引物-對病毒DNA-A進行PCR擴增，其中擴增所用PCR引物為：

BamHI上^a???????g?tgggatccac?ttctaaatg?????????????????????????

BamHI下?^a??????ggatcc?catattgcaagacagactac??????????

2356F^b??????????ggatggaaatgtgctgacct???????????????

BamR^?b??????????gtggatcccacatattgcaa??????????????

a：擴增全長的DNA-A序列；b：擴增0.4A的DNA-A序列；

????3）擴增產物克隆到pMD-19T載體上，分別命名為1.0A-pMD和0.4A-pMD并轉化到DH5a菌液中；

4）串聯重復的克?。河肂amHI酶切切下1.0A-pMD的病毒全長DNA；用BamHI切開含有0.4A病毒基因組片段的0.4A-pMD載體；利用試劑盒回收相應大小的片段，利用T4連接酶將二者相連得到1.4A-pMD重組載體，轉化至DH5a菌液中；

5）正向串聯重復序列的獲得：

1.0A和0.4A兩個片段，利用引物C擴增陽性克隆菌液，比較大小后選出正向串聯的菌落形成1.4A串聯的克??；所用引物為：

PMD19F?^c????????cgcc?aag?ctt?gca?tgccg??????????????

BamR?^c??????????gtggatcccacatattgcaa?；?????????????

6）表達載體的構建和轉化：

利用KnpI和SalI對含有1.4A?TYLCV的1.4A-pMD質粒和植物表達載體pRI?101-An進行雙酶切，然后利用T4連接酶將目的片段與表達載體進行連接得到1.4A-?pRI，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中；用凍融法將1.4A-?pRI直接轉化農桿菌LBA4404的感受態細胞，轉化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，28℃溫箱培養2～3d；挑取單菌落接種于2mI?含利福平50ug／mL?和卡那霉素100ug／mL?的YEB培養基中培養過夜后，取1mI菌液置于1.5mI?離心管，離心收集菌體，加50?L無菌水煮沸10min，取上清作模板進行PCR擴增，擴增產物用1．0%?瓊脂凝膠電泳驗證；

7）重組質粒的提取與鑒定：

用TAKARAMiniBEST?Plasmid?Purification?Kit?Ver.2.0（50次量）試劑盒進行質粒DNA的微量提取，利用SalI和KnpI雙酶切1.4A?-pRI，37℃酶切消化1h后瓊脂糖凝膠電泳檢查結果；

8）序列測定與分析：

數據處理借助DNAMAN?Version?6.0（Lynnon?Biosoft,QuebeCanada）進行，利用BLAST程序在GeneBank數據庫中尋找與DNA-A序列最相近的基因組序列；

9）農桿菌接種及病毒DNA的檢測和田間調查：

將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農桿菌LBA4404分別接種在含卡那霉素（50?ug/mL）和利福平（50?ug/mL）的YEB液體培養基中，28℃，200?rpm振蕩培養48?h，接種時，取一支1?mL的一次性注射器，吸取培養好的農桿菌菌液，在距離供試植株根部1-2?cm處取三點進行韌皮部注射，接種植株置于防蟲溫室中培養，在注射接種后30天，采集葉片約0.5克，抽DNA-A后進行PCR檢測，對植株高度和葉片進行癥狀的觀察。