[發(fā)明專利]用羥胺切割法制備天蠶素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110364583.2
• 申請(qǐng)日: 2011-11-04
• 公開（公告）號(hào): CN102532325A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 扈進(jìn)冬;鄭凱;楊合同;李紀(jì)順;魏艷麗;周紅姿;李紅梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/435;C07K14/46;C07K1/12;A61K38/17;A61P31/04;A23K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體涉及復(fù)合抗菌肽天蠶素AD和蛙Buforin?II的制備方法。?

背景技術(shù)

抗菌肽可通過干擾、阻斷多條細(xì)菌代謝途徑，發(fā)揮胞內(nèi)殺傷作用，從而抑制、殺滅細(xì)菌。不同種類、結(jié)構(gòu)的抗菌肽可以攻擊不同的胞內(nèi)靶點(diǎn)發(fā)揮其抗菌作用，某些種類的抗菌肽亦可兼具胞膜攻擊作用和胞內(nèi)殺傷作用，且存在多個(gè)作用靶點(diǎn)。由于抗菌肽作用機(jī)制及靶點(diǎn)的多樣化，使細(xì)菌不易通過變異產(chǎn)生耐藥性。并且，某些抗菌肽與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合使用時(shí)還具有協(xié)同作用。因此，抗菌肽有望成為新一代抗菌藥物或輔助治療藥物。?

天蠶素(Cecropins)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物抗菌肽，1980年，由Boman等從天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37～39個(gè)氨基酸殘基，不含半胱氨酸，其N端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結(jié)構(gòu)，而在C端區(qū)域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，N端在生理濃度下帶正電，C端均被酰胺化，酰胺化對(duì)其抗菌活性具有重要作用。所有天蠶素類抗菌肽其2位均為Try，這是該類抗菌肽最保守結(jié)構(gòu)，天蠶素B、D分別與A有65％和62％同源性，表明天蠶素在分子結(jié)構(gòu)上具有同源性，上述結(jié)構(gòu)是抗菌肽破壞菌膜的基礎(chǔ)。天蠶素類抗菌肽的作用機(jī)制與其電荷數(shù)和中間的柔性部位有直接關(guān)系是天蠶素類抗菌肽的作用機(jī)制假說。?

抗菌肽Cecropin?AD是人工合成的由Cecropin?A的N端1～11肽段和Cecropin?D的C端12～37肽段組成的雜合肽。Chen等在枯草芽孢桿菌中成功地表達(dá)了高抗菌活性的抗菌肽Cecropin?AD，且表達(dá)產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)穩(wěn)定性。?

抗菌肽Buforin?II是韓國(guó)學(xué)者Park等從亞洲蟾蜍的胃組織中分離純化的有21個(gè)殘基的抗菌肽，其抗菌活性很強(qiáng)，抗菌譜廣，在不破壞細(xì)胞膜的前提下，高效穿過細(xì)胞膜后進(jìn)入胞質(zhì)強(qiáng)烈結(jié)合DNA，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。?

Buforin?II雖然理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)和其他α螺旋多肽類似，但其作用機(jī)制已被提出和多數(shù)作用于膜的多肽有所不同，Buforin?II和Pyrrhocoricin、indolicidin，以及富含Pro、Arg的抗菌肽PR-39作用機(jī)制相似，但也有區(qū)別。Buforin?II在不引起細(xì)胞膜溶解的情況下，能快速穿透質(zhì)膜，并于胞內(nèi)累積，通過與核酸分子結(jié)合，殺滅細(xì)菌。Buforin?II的C端區(qū)域是組蛋白H₂ADNA結(jié)合基序的一部分，在于DNA的相互作用中有重要作用，是Buforin?II的殺菌基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究Buforin?II及其氨基酸突變體與DNA分子的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，Buforin?II類抗菌肽與?DNA分子的親合能力與其抗菌能力呈正相關(guān)。同時(shí)，Buforin?II與DNA分子結(jié)合不僅存在靜電相互作用，而且存在著特異性結(jié)合位點(diǎn)。?

由于從動(dòng)物或微生物中提取抗菌肽的產(chǎn)量少，成本高，所以用現(xiàn)代生物技術(shù)表達(dá)抗菌肽成為目前研究的熱點(diǎn)。目前抗菌肽基因工程表達(dá)主要在大腸桿菌和酵母菌系統(tǒng)中進(jìn)行。酵母菌表達(dá)體系具有直接分泌表達(dá)抗菌肽的潛力，但酵母菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，含較多堿性氨基酸的抗菌肽易被降解，表達(dá)效率并不高；該表達(dá)系統(tǒng)還存在N端信號(hào)肽剪切不完全，直接影響到抗菌肽的活性；同時(shí)還存在對(duì)表達(dá)的抗菌肽進(jìn)行修飾的潛在問題，如糖基化、甲基化等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快、表達(dá)量高、對(duì)表達(dá)抗菌肽不存在修飾等優(yōu)點(diǎn)，但抗菌肽在大腸桿菌中直接表達(dá)、對(duì)大腸桿菌本身具有毒性，一般采用融合表達(dá)策略。然而現(xiàn)在通用的大腸桿菌融合表達(dá)方式是采用大腸桿菌自身蛋白作為融合蛋白對(duì)抗菌肽進(jìn)行表達(dá)。如采用兩種不同抑菌機(jī)制的抗菌肽融合表達(dá)，產(chǎn)物在未形成正確結(jié)構(gòu)時(shí)不會(huì)對(duì)宿主菌產(chǎn)生毒性，并且能夠提高表達(dá)效率，兩種抗菌肽切割成獨(dú)立后便具有抑菌效果，兩種協(xié)同作用能夠增強(qiáng)抑菌效果。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)含兩種不同抑菌機(jī)制的抗菌肽融合蛋白，并在融合蛋白的N端與his標(biāo)簽之間以及在兩種抗菌肽之間引入了羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly，羥胺是一種廉價(jià)的化學(xué)試劑可以專一性的切割蛋白和多肽中的Asn-Gly肽鍵。從而使生產(chǎn)成本降低，純化工藝簡(jiǎn)化。?

本發(fā)明提供了高效表達(dá)含兩種不同抑菌機(jī)制的抗菌肽融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET-Trx-CAD-Buforin?II，其包N端有3個(gè)His形成立體His-patch，序列中有2個(gè)羥胺切割位點(diǎn)，有利于表達(dá)純化。?

本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞是E.coli?BL21(DE3)plysS，具有氯霉素抗性。?