[發明專利]用羥胺切割法制備天蠶素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途

有效

• 申請號: 201110364583.2
• 申請日: 2011-11-04
• 公開（公告）號: CN102532325A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 扈進冬;鄭凱;楊合同;李紀順;魏艷麗;周紅姿;李紅梅
• 申請（專利權）人: 山東省科學院中日友好生物技術研究中心
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/435;C07K14/46;C07K1/12;A61K38/17;A61P31/04;A23K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

1.一種含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白，其特征在于天蠶素AD和蛙Buforin?II的之間引入羥胺切割位點，并直接相連。

2.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白，其特征在于：在天蠶素AD和蛙Buforin?II之間以及天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白N端序列之前各引入一個羥胺位點Asn-Gly，從而使大腸桿菌表達融合蛋白可以使用羥胺來切割釋放天蠶素AD和蛙Buforin?II。

3.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的制備方法，其特征在于設計人工合成四對引物，通過3輪PCR，合成天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合基因-CAD-Buforin?II基因。

4.如權利要求3所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的制備方法，其特征在于所說的四對引物的序列如序列2-8所示。

5.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的表達質粒，其特征在于由質粒pET-Trx與人工合成的CAD-Buforin?II基因片段，用BamH?I和EcoR?I雙酶切，連接而成的質粒pET-Trx-CAD-Buforin?II，其N端有3個His形成立體His-patch，序列中有2個羥胺切割位點，有利于表達純化。

6.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的表達工程菌株，其特征是由表達質粒pET-Trx-CAD-Buforin?II轉化E.coli?BL21細胞獲得的最高表達量的菌株，該菌株為已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏；名稱為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)Trx-PC6/BL21，保藏號為CGMCC?No.4588。

7.應用權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白，制備天蠶素AD和蛙Buforin?II復合抗菌肽的方法，其特征在于包括融合抗菌肽CAD-Buforin?II的大規模表達、提取、分離純化、羥胺切割裂解各步驟，制得含有天蠶素AD和蛙Buforin?II的復合抗菌肽。

8.如權利要求7所說的準備復合抗菌肽的方法，其特征在于所說的羥胺切割條件為：加入鹽酸羥胺濃度至1-4M，調pH值至7.0-9.5，在35-50℃下，切割1-12個小時。

9.如權利要求7所準備的天蠶素AD和蛙Buforin?II復合抗菌肽的用途，其特征在于用于藥物和飼料添加劑。