[發明專利]一種F蛋白檢測試劑及檢測方法

無效

• 申請號: 201110364274.5
• 申請日: 2011-11-16
• 公開（公告）號: CN102721814A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 劉樹業;任峰
• 申請（專利權）人: 天津美德太平洋科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 董一寧

技術領域

本發明專利屬于生物醫學工程和醫學檢驗技術領域，尤其是指一種F蛋白檢測試劑及檢測方法。

背景技術

在生物醫學工程關于細胞的科研領域及醫學臨床應用中，F蛋白是一種特異存在于肝細胞中的蛋白質，只有當肝實質受損方釋放入血液中，因此現代醫學認為F蛋白是一種特異的肝細胞損害標志物。肝病的診斷一直是醫學診斷學中一個重要的組成部分，肝臟F蛋白作為一種可直接反映肝損傷程度的血清學標志，其血清含量與各種原因造成的肝損傷程度成正相關。無論何種原因導致的肝病，均表現為肝細胞損害，血清中F抗原均可升高。血清F抗原的含量變化與肝組織學改變有密切的相關性。血清F抗原為肝臟特有，敏感性非常高，正常人血清F抗原濃度無年齡、性別差異，肝細胞受損時血液中出現的時間早，而且是不可誘導的，因此，血清F抗原是一種新的比常規肝功能項目更靈敏而特異的指標。如果制成F蛋白的免疫試劑，其將在肝病早期診斷與治療、藥物的篩選與療效觀察、肝病預后的判斷等方面發揮重要作用。

目前國內外獲得F蛋白比較困難且缺乏統一的標準，難以相互驗證，不利于研究工作的深入；國內外有學者通過提純的方法提取F蛋白，利用這種方法很難得到大量且較純的F蛋白；迄今為止用基因克隆的方法獲得F蛋白的基因序列只有在大鼠中獲得F蛋白克隆的報道，未見人肝臟F蛋白的克隆和表達的文獻報道，同時Genebank上亦沒有相應的序列發布。

在查閱大量國內外相關文獻基礎上，我們參照與人類同源性較高的大鼠肝臟F蛋白的基因序列先后設計了10對不同的上下游引物，成功擴增出人肝臟F蛋白基因序列。我們將人類肝臟F蛋白的基因序列在NCBI的GENEBANK上發布(序列號DQ188836)，并對此序列進行了Blast比對，結果顯示，人類肝臟F蛋白的基因序列與大鼠肝臟F蛋白的基因序列的同源性高達99％。進而利用已獲得的F蛋白的cDNA在原核載體(大腸桿菌BL21(DE3)pLysS)表達出F蛋白，使F蛋白的大量制備成為可能，解決其來源問題；通過改進提純的方法一方面得到人肝臟F蛋白的提純品，另一方面將提純的F蛋白與克隆表達的F蛋白通過免疫特性相互驗證；同時制備其多克隆抗體和單克隆抗體，并通過多克隆抗體檢測部分臨床標本，來初步驗證F蛋白作為一種臨床診斷試劑的可行性，為使F蛋白的研究盡快地從實驗室走向臨床奠定更堅實的基礎。

在眾多的免疫測定技術中，酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)應用最為廣泛，最具代表性。ELISA是60年代末，在酶免疫組織化學的基礎上由Engvall和Perlmann以及Van?Weeman和Schuurs等發展的一種酶標固相免疫測定技術。這種簡單方便的免疫測定技術出現后，不但成為了一種非常簡便的研究工具，而且迅速地應用于各種生物活性物質及標志物的臨床檢測，并在臨床應用中逐漸取代了有環境污染、廢液難以處理等缺點的放射免疫試驗。免疫測定的基礎在于抗原抗體之間的特異結合反應，而ELISA顧名思義就是以酶作為標記物、以抗原抗體免疫反應為基礎的固相吸附測定方法。ELISA的測定試劑的有機組成部分包括三個方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標記的抗體或抗原和酶反應底物等。抗原或抗體的固相化并不影響其免疫結合活性，酶標記的抗原或抗體亦是如此，并且標記酶的活性不因標記過程而喪失。整個測定中，抗原抗體結合反應在固相支持物上進行，反應結果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產生的熒光或發光反應為準則，顯色或產生熒光的強度與臨床標本中待測物的濃度成正比或反比關系。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，近年來隨著分子生物學技術的發展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結合物等免疫測定試劑已成為現實，各種新型實用的測定方法不斷出現，進一步拓寬了免疫測定技術的發展途徑。