[發明專利]轉基因玉米NK603品系特異定量PCR精準檢測方法

無效

• 申請號: 201110363639.2
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN102409094A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 宋君;郭靈安;雷紹榮;張富麗;王東;尹全;劉文娟;常麗娟
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院分析測試中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 成實

技術領域

本發明屬于生物技術，涉及基因的定量的分析方法。

背景技術

國際上很多國家對轉基因產品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉基因產品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，同時彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系，更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，建立一種新型轉基因玉米NK603品系特異定量PCR精準檢測方法已成為必要。

并且目前關于轉基因玉米NK603的檢測技術，主要集中在普通定性PCR分析方法和標準，尚無關于擴增檢測轉基因玉米NK603及產品的品系特異性某特定位點（基因序列）的定量PCR精準檢測技術。

發明內容

本發明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米NK603及產品的品系特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術。

本發明通過下述技術方案實現：

轉基因玉米NK603品系特異定量PCR精準檢測方法，主要包括以下步驟：

（1）合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，Event603-F:?5'-TCTCTGGCATTTCCAACCCT-3'

下游引物序列，Event603-R:?5'-TCTCAAGCATATGAATGACCTCG-3'

熒光探針序列，Event603-P:?5'-FAM-TGCGTCCCTGGTGGGCTGC-TAMRA-3'；

（2）制備NK603品系的DNA稀釋液；

（3）配制PCR反應體系；

（4）定量PCR檢測。

進一步，步驟（1）所述合成的引物及熒光探針的濃度都為10μmol/l，步驟（2）所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/μl。

為了達到最好的檢測效果，步驟（3）所述的配制PCR反應體系，即將3μl的DNA稀釋液加入到25μl反應體系中，所述25μl的反應體系包括以下組分：

Taqman?Master?mix????????????????????????12.5μl

上游引物?????????????????????????????????1μl

下游引物?????????????????????????????????1μl

熒光探針?????????????????????????????????0.5?μl

水???????????????????????????????????????10ul。

作為最優的反應條件，所述PCR反應條件為：95℃預變性10min，1個循環；95℃變性15s，59℃退火60s，45個循環。

本發明具有以下優點及有益效果：

1、本發明打破了歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘。

2、本發明彌補和完善了我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系。

3、本發明提供的檢測技術可更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權。

4、本發明擴增效率高、準確度高。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式并不限于此。

實施例

轉基因玉米NK603品系特異定量PCR精準檢測方法，主要包括以下步驟：

（1）合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，Event603-F:?5'-TCTCTGGCATTTCCAACCCT-3'

下游引物序列，Event603-R:?5'-TCTCAAGCATATGAATGACCTCG-3'

熒光探針序列，Event603-P:?5'-FAM-TGCGTCCCTGGTGGGCTGC-TAMRA-3'。

本實施例引物及熒光探針的合成濃度都為10μmol/l。

以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對轉基因玉米NK603及產品的品系特異性某特定位點，即外源基因與玉米基因組DNA的整合位點設計，通過該設計就可以精準檢測轉基因玉米中NK603的轉化事件。

（2）制備NK603品系的DNA稀釋液；即采用常規的DNA提取手段，從轉基因玉米NK603中提取出濃度為50ng/μl的DNA稀釋液。

（3）配制PCR反應體系；即將3ul制備好的DNA稀釋液加入25ul反應體系中即可。