[發(fā)明專利]一種野油菜黃單胞菌必需基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110363301.7
• 申請日: 2011-11-16
• 公開（公告）號: CN102399793A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 錢韋;彭寶玉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12Q1/68;C07K14/21;G01N33/68;C12N15/70;C12R1/64;C12R1/19
• 代理公司: 北京衛(wèi)平智業(yè)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11392
• 代理人: 楊靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種野油菜黃單胞菌必需基因及其編碼的蛋白及應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)菌的必需基因(essential?gene)是指維持細(xì)菌細(xì)胞正常生長和繁殖所必需存在的基因。必需基因一般編碼細(xì)胞代謝活動和生化過程里的關(guān)鍵分子，如核酸、氨基酸、脂肪和細(xì)胞壁合成代謝、細(xì)胞分裂、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、基因表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵蛋白。其突變或失活將直接導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞生長停滯或死亡。因此，必需基因也是發(fā)展新型抗生素或抑菌化合物的理想藥物作用靶標(biāo)，可利用其編碼產(chǎn)物的生物學(xué)活性或穩(wěn)定性，對可能的抗菌化合物進(jìn)行篩選。細(xì)菌的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component?signal?transduction?system)則由組氨酸激酶(histidine?kinase)和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response?regulator)組成，是細(xì)菌感應(yīng)外界環(huán)境刺激和調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)的主要分子機(jī)制。當(dāng)細(xì)菌感受到特定環(huán)境刺激時，組氨酸激酶會自磷酸化(autophosphorylation)，隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給下游的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。被磷酸化后的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生變構(gòu)作用，激活其C末端的信號輸出區(qū)(往往具有轉(zhuǎn)錄因子活性)并調(diào)控下游基因的表達(dá)。必需雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因曾在多種病原細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于抗生素的篩選，如枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)中的yycF-yycG(Fabret?C?and?Hoch?JA.1998.A?two-component?signal?transduction?system?essential?for?growth?of?Bacillus?subtilis：implication?for?anti-infective?therapy.Journal?of?Bacteriology.180：6375-6383)，以及結(jié)核分枝桿菌的mtrA基因(Zahrt?T?and?Deretic?V.2000.An?essential?two-component?signal?transduction?system?in?Mycobacterium?tuberculosis.Journal?of?Bacteriology.182：3832-3838)。

十字花科植物(如甘藍(lán)、白菜、芥菜、蘿卜、擬南芥等)黑腐病病原-野油菜黃單胞菌(Xanthomonas?campestris?pv.campestris)的核酸序列已由基因組測序項目報道(Qian?W，Jia?YT，He?YQ?et?al.2005.Comparative?and?functional?genomic?analyses?of?the?pathogenicity?of?phytopathogen?Xanthomonas?campestris?pv.campestris.Genome?Research，15：757-767.)，盡管該項目對野油菜黃單胞菌中的基因進(jìn)行了分析，但其具體基因的生物學(xué)功能和應(yīng)用并未由實驗加以證明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是在上述野油菜黃單胞菌基因組測序項目基礎(chǔ)上，利用實驗分析對可能的基因功能基因進(jìn)行證明獲得的成果，涉及野油菜黃單胞菌必需反應(yīng)調(diào)節(jié)基因及其編碼的蛋白，該基因和它編碼的蛋白是野油菜黃單胞菌生長所必需的，因此可以作為篩選預(yù)防十字花科植物黑腐病農(nóng)藥的靶標(biāo)。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種野油菜黃單胞菌必需基因，具有序列表中SEQ?ID?No.1的DNA序列或者是編碼序列表SEQ?ID?No.2的氨基酸序列的多核苷酸。該基因被命名為phoP基因。

所述必需基因的檢測方法為：

1)利用序列表中SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4的多核苷酸作為引物，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增序列表中的SEQ?ID?No.1的核苷酸序列全長片段；

2)將擴(kuò)增出的核苷酸序列克隆到載體上，獲得在嚴(yán)謹(jǐn)性啟動子控制下的重組載體；

3)將重組載體轉(zhuǎn)入野油菜黃單胞菌菌株中獲得重組菌株；

4)利用重組自殺載體對重組菌株染色體上的必需基因核苷酸序列進(jìn)行讀框內(nèi)刪除獲得突變體；

4)將該突變體置于培養(yǎng)基中，利用添加的嚴(yán)謹(jǐn)性物質(zhì)作為誘導(dǎo)物，控制突變體中重組必需基因的轉(zhuǎn)錄水平，檢測該必需基因?qū)σ坝筒它S單胞菌生長的影響；

5)確定該基因是否為必需基因。所述基因的轉(zhuǎn)錄被控制后，野油菜黃單胞菌的生長受到抑制，說明該基因為野油菜黃單胞菌生長特異性的必需基因。

所述重組自殺質(zhì)粒的制備方法為：