[發(fā)明專利]一種野油菜黃單胞菌必需基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110363301.7
• 申請(qǐng)日: 2011-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102399793A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢韋;彭寶玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12Q1/68;C07K14/21;G01N33/68;C12N15/70;C12R1/64;C12R1/19
• 代理公司: 北京衛(wèi)平智業(yè)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11392
• 代理人: 楊靜

1.一種野油菜黃單胞菌必需基因，具有下述核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ?ID?No.1的DNA序列；

(2)編碼序列表SEQ?ID?No.2的氨基酸序列的多核苷酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野油菜黃單胞菌必需基因，其特征在于，所述必需基因的檢測(cè)方法為：

1)利用序列表中SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4的多核苷酸作為引物，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增序列表中的SEQ?ID?No.1的核苷酸序列全長(zhǎng)片段；

2)將擴(kuò)增出的核苷酸序列克隆到載體上，獲得在嚴(yán)謹(jǐn)性啟動(dòng)子控制下的重組載體；

3)將重組載體轉(zhuǎn)入野油菜黃單胞菌菌株中獲得重組菌株；

4)利用重組自殺載體對(duì)重組菌株染色體上的必需基因核苷酸序列進(jìn)行讀框內(nèi)刪除獲得突變體；

4)將該突變體置于培養(yǎng)基中，利用添加的嚴(yán)謹(jǐn)性物質(zhì)作為誘導(dǎo)物，控制突變體中重組必需基因的轉(zhuǎn)錄水平，檢測(cè)該必需基因?qū)σ坝筒它S單胞菌生長(zhǎng)的影響；

5)確定該基因是否為必需基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的野油菜黃單胞菌必需基因，其特征在于，所述重組自殺質(zhì)粒的制備方法為：

1)分別用PCR擴(kuò)增必需基因的上游基因和下游基因，獲得上游基因片段和下游基因片段；

2)將上游基因片段和下游基因片段分別克隆到自殺載體中獲得重組自殺載體。

4.一種野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，具有序列表中SEQ?ID?No.2的氨基酸序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，其特征在于所述蛋白為野油菜黃單胞菌生長(zhǎng)所必需的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，其特征在于所述反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的檢測(cè)方法為：

1)將³²P標(biāo)記的醋酸磷酸與野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白混合；

2)提取混合物樣品，利用電泳方法分離并進(jìn)行同位素信號(hào)檢測(cè)確定所述蛋白是否被磷酸化。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，其特征在于所述反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的檢測(cè)方法為：

1)將α-³²P標(biāo)記的組氨酸激酶與野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白混合；

2)提取混合物樣品，利用電泳方法分離并進(jìn)行同位素信號(hào)檢測(cè)確定所述蛋白是否被磷酸化。

8.一種制備野油菜黃單胞菌必需基因編碼的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的方法，包括如下步驟：

1)利用序列表中SEQ?ID?No.9和SEQ?ID?No.10的多核苷酸作為引物，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增序列表中的SEQ?ID?No.1的核苷酸序列全長(zhǎng)片段；

2)將擴(kuò)增出的核苷酸序列連接到載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株上；

3)將獲得的大腸桿菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)后離心收集裂解后進(jìn)行親和層析獲得重組蛋白。

9.一種控制野油菜黃單胞菌生長(zhǎng)的方法，以野油菜黃單胞菌中的蛋白或編碼該蛋白的基因作為靶標(biāo)篩選能控制野油菜黃單胞菌的物質(zhì)，所述蛋白具有序列表中的SEQ?ID?No.2的氨基酸序列；所述編碼該蛋白的基因具有序列表中的SEQ?ID?No.1的核苷酸序列。

10.根據(jù)權(quán)利要求9的控制野油菜黃單胞菌生長(zhǎng)的方法，其特征在于，所述方法是以控制野油菜黃單胞菌所述基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)控制野油菜黃單胞菌的生長(zhǎng)。