[發明專利]一種造血嵌合體實時定量PCR檢測中嵌合體的合成方法

無效

• 申請號: 201110362955.8
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102399881A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 虞強
• 申請（專利權）人: 江蘇邁健生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種造血嵌合體實時定量PCR檢測方法，特別涉及一種利用熒光染料SYBR?green來檢測造血嵌合體的實時定量PCR檢測中的嵌合體的合成方法。

背景技術

隨著異體造血干細胞用來治療各種惡性和非惡性的血液疾病，許多病人延長了總的存活時間和無病生存時間。導致治療失敗的主要原因是疾病復發，移植物被排斥，移植物抗宿主病。因此定量分析病人異體干細胞移植后供體嵌合體是用來診斷移植物成活，早期檢測和治療疾病復發，移植物排斥反應的重要工具。異體造血干細胞移植后的嵌合體的監測已成為常規檢查手段，特別是在RIC(Reduced?Intensity?Conditioning，降低強度條件)的異體移植，異體干細胞移植后供體嵌合體的結果可用來指導是否進行干預治療，特別在改變免疫抑制治療和治療疾病的復發起到了決定性作用。

造血嵌合體的檢測可以利用受體和供體多態性遺傳標記或它的產物的不同來測量。目前廣泛應用的方法包括細胞遺傳學，紅細胞分型，限制性片段長度多態性分析和免疫熒光原位雜交(Fluorescence?In?Situ?Hybridization，FISH)技術通過XY染色體探頭來測定。但是以上方法或者費時，或者不適用于所有病人。比如免疫熒光原位雜交(FISH)技術是通過XY染色體探頭來測定造血嵌合體的，因此只適用于受體和供體是不同性別的異體造血干細胞移植；而紅細胞分型方法只適用于不同血型的受體和供體。

近年來用PCR(Polymerase?Chain?Reaction，聚合酶鏈式反應)實時定量檢測造血嵌合體的方法因其應用的廣泛和高靈敏度而越來越多地被使用。目前被接受的分子生物學方法是用PCR方法檢測Microsatellite序列--一種短而重復不編碼的序列。因為在不同的受體和供體中，此序列的重復數量不同從而造成PCR產物的大小不同。進而用丙烯酰胺凝膠電泳和自動序列分析PCR產物。此方法靈敏度相對較低(1～5％)，而且費時，費力，價格昂貴。

最近一種新的應用TaqMan技術檢測單核甘酸多態性(SNP，Single?Nucleotide?Polymorphisms)的實時定量PCR方法被建立起來。SNP是等位基因變異，廣泛表達在人的染色體編碼與非編碼區。大約每1000個堿基對就有一個單核苷酸多態性發生，因此為嵌合體的分析提供了一個廣泛的信息標記庫。此TaqMan技術的實時定量PCR方法需要應用特異的TaqMan探頭，有價格昂貴而且保質期短的缺點。相比而言，能納入雙鏈PCR產物的熒光染料SYBR?green因其便宜，高靈敏度而被廣泛應用于實時定量PCR方法上。

發明內容

本發明的目的是建立了一種利用熒光染料SYBR?green來檢測造血嵌合體的實時定量PCR檢測新方法及其嵌合體的合成方法，所述PCR檢測新方法可以提高PCR檢測的靈敏度，耗時低且節省費用。

為達到本發明的目的，本發明的檢測造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法包括以下步驟：

S1.收集標本；

S2.選擇多態性遺傳標記設計引物和探針(probe)；

S3.實時定量PCR檢測造血嵌合體；

S4.人工合成12個不同稀釋濃度的造血嵌合體；以及

S5.統計學分析。

造血嵌合體的檢測關鍵在于選擇可以區分受體和供體的特異性多態性遺傳標記。本發明中介紹了12個可以用于實時熒光定量PCR(Real?time?Q-PCR)來檢測造血嵌合體的特異性多態性遺傳標記。用此12個多態性遺傳標記對37對供體和受體進行篩選，結果表明每個多態性標記的信息性(informativity)在3％至47％之間。12個多態性遺傳標記可以區別94％的供體和受體。除一對同卵雙胞胎外，所有37對供體和受體都可以找到適合的特異性多態性標記進一步進行定量PCR來檢測造血嵌合體。

為了彌補熒光染料SYBR?green納入雙鏈DNA是非特異性的，同時運行熔解曲線(melting?curve)可以用來驗證PCR產物的特異性。進一步用人工合成12個不同稀釋濃度的造血嵌合體(從0.01％至100％)，利用供體DNA來稀釋受體DNA或受體DNA來稀釋供體DNA，標準的擴增曲線由供體或受體特異的等位基因位點的PCR來擴增以上人工合成的造血嵌合體來作出。供體或受體的陰性等位基因可以用來作為陰性對照。移植后的供體細胞的百分比可以從標準的擴增曲線計算出來。