[發明專利]反轉錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達中的反轉錄反應體系

無效

• 申請號: 201110362856.X
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102864211A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 金星亮;白麗君;常菁
• 申請（專利權）人: 江蘇邁健生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種IVF(In?Vitro?Fertilization，試管受精)單個植入前胚胎的基因表達分析方法，特別涉及以一種利用改良實時定量反轉錄PCR(Polymerase?Chain?Reaction，聚合酶鏈式反應)技術分析IVF單個植入前胚胎的基因表達方法中的反轉錄反應體系。?

背景技術

1978年7月25日，世界上第一個成功的“試管”嬰孩(IVF，試管受精)路易絲喜悅布朗，在英國出生。從此，IVF為全球超過占10％的不孕癥夫婦帶來了福音。發明IVF的英國科學家羅伯特愛德華茲教授被授予2010年諾貝爾醫學生理學獎。然而，三十多年的臨床實踐并沒有顯著提高IVF的成功率。如，2011年，美國妊娠協會統計35歲病人IVF成功率(受孕率)在25-30％左右，而1997年也在30％左右。而嬰兒出生率更低。其中一個重要的原因是IVF胚胎培養液的質量。這是IVF胚胎質量最重要的決定性因素之一。?

目前，選擇植入母體的囊胚期胚胎主要是根據胚胎的形態學特性。而迄今尚未有一種特殊的生物學標記及監測手段來確定培養液和胚胎質量。胚胎質量與胚胎學家的經驗密切相關。這種人為的選擇實際上存在潛在的危險性。因為即使有優良形態學特性的胚胎仍可能存在基因突變和缺陷。如Sirtuins蛋白通過調節線粒體能量代謝功能，在IVF植入前胚胎期發揮了重要的作用。Sirt3基因的缺陷誘導了腫瘤抑制蛋白trp53的表達而抑制了胚胎的發育。如果sirt3基因和trp53基因同時缺陷，可改善胚胎的發育。這種情況也可見于單獨trp53基因缺陷時，而胚胎表現為正常的形態學特性。在利用實時定量反轉錄PCR(Real-time?quantitative?reverse?transcription?polymerase?chainsreaction)方法檢測小鼠受精卵體外培養72-96小時后的胚胎發現一組胚胎中總的腫瘤抑制基因trp53mRNA總量明顯低于體內生長的同期?胚胎。RNA微陣列(RNA?Microarray)也顯示小鼠一組IVF囊胚期胚胎明顯比體內生長的囊胚期胚胎表達了低的trp53mRNA。目前尚未知道這組胚胎中有多少個胚胎不表達trp53，如果這個trp53基因缺陷的胚胎植入至母體，下一代的腫瘤發生率無疑將大大增高。Microarray顯示小鼠受精卵體外在Whitten氏培養液和KSOM+氨基酸培養液培養96小時所形成的囊胚期胚胎分別有114和29個基因表達異常。我們對目前臨床常用的三種IVF培養液中生長成的小鼠囊胚期胚胎的分析顯示52-102個基因表達異常，異常程度非常不同，而且影響了許多關鍵的細胞功能和重要器官的發育。例如：1.決定干細胞潛能性的轉錄因子，Nanog和UTF1；2.干細胞分裂和維持功能；3.心室肌細胞的發育，肺泡細胞的發育，大腦皮層神經元的分化和突觸的發育；4.B淋巴細胞的分化；5.細胞對DNA損傷的反應；6.細胞清除極低密度脂蛋白的能力，等等。這說明目前臨床常用IVF培養液可能存在缺陷，也就是說迄今我們尚未有最理想的IVF培養液。其中主要的原因是尚未有可靠有效的手段來監測IVF培養液的質量。?

雖然微陣列(Microarray)分析提供了強有力的工具來分析單一實驗過程中成千上萬個基因的表達。然而它并不適合于樣品的RNA量相當小的時候(對于Microarray，通常每個樣品至少需要50ng?RNA，我們的經驗需要100個以上囊胚期胚胎)。這不可能用人類單個IVF病例的100個囊胚期胚胎作Microarray分析，換句話說，Microarray目前并不能作為人類檢測IVF胚胎的基因表達的手段。另一種重要的情況是不同基因在卵子和各植入前胚胎期的表達形式差別很大，尤其當被測基因的RNA轉錄子的豐度低，而且它的轉錄子壽命又較短，而這種特性可能在調節植入前胚胎期功能發揮了關鍵的作用，這種瞬時表達的基因用Microarray分析技術也不易監測到。?

發明內容

為解決RNA?Microarray在基因表達分析中的不足，本發明提供了一種改良的實時定量反轉錄PCR，這是一種有效的用于分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎表達的方法。這種改良的實時定量反轉錄PCR技術操作要求相當高，但非常敏感，高度精確，同時能產生可?觀的資料。利用這種方法，可以彌補Microarray的不足，對分析單個關鍵基因在單個細胞的表達和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應用價值。這種技術還提供了有效的方法去檢測那些潛在重要的瞬時表達的RNA轉錄子，和怎樣估價并且解釋在總RNA池完成的基因表達分析的結果，不至于掩蓋那些相對穩定表達的轉錄子的重要信息。?