[發明專利]一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法

無效

• 申請號: 201110362485.5
• 申請日: 2011-11-16
• 公開（公告）號: CN102344968A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 虞云龍;董斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及生態環境保護領域，主要涉及一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法。

背景技術

轉基因作物的研制與應用是提高我國農業生產效率、有效解決我國的糧食安全問題的重要途徑。轉基因作物的釋放與規模生產對農業生態環境可能產生一定的影響，客觀評價轉基因作物對農業生態環境的可能影響是轉基因作物研究和發展的重要基礎和現實問題。

土壤是農業生產的載體，轉基因作物種植與土壤生態系統間將發生一系列交互作用，轉基因作物的外源基因及其表達產物可通過多種途徑進入土壤生態系統，其中最直接的途徑有：1)根系分泌物：轉基因作物根系表達的毒素蛋白和根系分泌物不斷地向作物根際周圍土壤釋放外源基因及其表達產物；2)作物殘茬：轉基因作物的外源基因及其表達產物可通過收割前后遺留在田間的根茬和殘枝落葉等進入土壤；3)轉基因作物花粉的散布使外源基因逃逸并進入土壤。

轉基因作物的外源基因及其表達產物進入土壤，與土壤微生物接觸，對其產生不同程度的影響。研究表明轉基因作物種植會對某些特定的微生物發生影響，如抗草甘膦大豆的種植會促進大豆根腐鐮刀菌(Fusarium?spp.)的生長和定殖，使該轉基因大豆品種的應用受到一定的制約。轉Bt基因水稻(克螟稻)秸稈還田對水田土壤反硝化細菌和產甲烷細菌種群有顯著的抑制作用，對厭氧發酵細菌種群有顯著的刺激作用，對厭氧固氮細菌種群有輕微刺激作用。特定微生物的改變將反映在土壤微生物結構和功能上的變化，如，轉基因油菜根際微生物組成的差異導致轉和非轉基因油菜品種根際微生物在碳素利用方式和脂肪酸甲基酯圖譜方面明顯不同。已知多種作物的多個轉基因品系及其殘體可以改變土壤微生物群體的組成，但這些改變也同時受檢測技術、田間土壤性狀、季節變化等的影響。因此，準確檢測轉基因種植土壤微生物變化是評估轉基因作物釋放生態風險的重要基礎。

發明內容

本發明提供了一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法，為轉基因水稻對土壤生態系統安全評估提供技術手段。

一種檢測轉基因水稻根際土壤微生物結構變化的方法，包括：

(1)分別采集轉基因水稻在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的根際土壤，將根際土壤在20-30℃下風干，過2-3mm篩后溶于緩沖液，得到混合液；

(2)提取混合液中微生物的總DNA，以該總DNA為模板，PCR擴增所述微生物的16SrDNAV3片段，擴增產物經溫度梯度凝膠電泳分離，染色得到所述微生物的DNA指紋圖譜；

(3)對各生長階段轉基因水稻根際土壤微生物的DNA指紋圖譜進行分析，得到轉基因水稻根際土壤微生物的結構變化情況。

所述的溫度梯度凝膠電泳采用的凝膠溶液為放置30天后的聚丙烯酰胺凝膠溶液。

所述的溫度梯度凝膠電泳的條件為：電壓160-200V、溫度42-50℃，電泳時間3-4h。

所述的提取混合液中微生物的總DNA的方法為：采用FastPrep核酸提取儀和FastDNA?SPIN?Kit?for?soil試劑盒提取。

所述PCR擴增所采用的正向引物和反向引物的堿基序列分別如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示。

本發明檢測方法操作簡便，TGGE圖譜條帶豐富，檢測的土壤細菌完整性強，且有效克服了土壤腐殖質的干擾，能夠對轉基因水稻根際土壤微生物結構變化做出準確測定。

附圖說明

圖1為華池B6、嘉早935、中九B種植期間不同生長期的土壤樣品16S?rDNA?V3區TGGE指紋圖譜，其中，1-3泳道為華池B6，4-6泳道為嘉早935，7-9用到為中九B；A分蘗期，B抽穗期，C灌漿期，D成熟期；

圖2為華池B6、嘉早935、中九B第一年種植期間不同生長期的土壤樣品16S?rDNAV3區TGGE指紋圖譜主成分分析圖，其中：A分蘗期，B抽穗期，C灌漿期，D成熟期。

具體實施方式

水稻材料

Bt水稻華池B6、親本嘉早935和遠緣親本中九B

田間試驗與采樣

田間實驗在浙江省建德市苗木基地進行，試驗田劃分為9個小區，分別種植這三個水稻品種，每個品種均設3個重復小區，每個小區26-28行×12株/行≥300株，不同品種的小區間隔設置。