[發明專利]奧爾森派琴蟲可視化環介導等溫擴增檢測試劑及檢測方法

有效

• 申請號: 201110362400.3
• 申請日: 2011-11-16
• 公開（公告）號: CN102363812A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 謝芝勛;龐耀珊;謝麗基;謝志勤;鄧顯文;劉加波;范晴
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

技術領域

本發明屬于環介導等溫擴增檢測技術領域，尤其涉及了可視化環介導等溫擴增（LAMP）檢測技術在海水貝類奧爾森派琴蟲檢測中的應用。

背景技術

派琴蟲是影響貝類養殖業發展的主要病原，為世界動物衛生組織規定的必報水生動物疫病之一，可感染蛤仔、扇貝、牡蠣、鮑魚、貽貝等貝類。在歐洲、美洲和亞洲等海域均有過貝類感染的報道。2000年，我國黃海沿岸爆發了菲律賓蛤仔的大規模死亡，派琴蟲是其中危害最大的病原生物之一。

在我國，目前由于派琴蟲的檢測技術有液體巰基醋酸鹽培養基(RFTM)培養方法、PCR/熒光PCR檢測方法。如中國專利申請號為2008102246547公開了一種用于派琴蟲檢測的實時熒光PCR引物和探針，所述的引物對特異性針對派琴蟲基因組DNA中ITS2序列的保守區域，所述探針特異性針對于該引物對擴增區域中的GC高含量區，該探針的5’端具有報告熒光染料標記，3’端具有淬滅熒光染料標記。但是液體巰基醋酸鹽培養基(RFTM)培養方法即可培養派琴蟲，也可以培養某些雙鞭毛類，缺乏專一性，而且僅能檢測到派琴蟲的休眠孢子，同時RFTM檢測方法需要7天時間，敏感度較低，只有當每克組織內原蟲數量高于1000個時方可檢出，因此在實際工作中具有一定的局限性。對于PCR/熒光PCR檢測方法，雖然其敏感性高、特異性強，但是其通常需要昂貴、精密的一起設備，對實驗環境和操作者技術要求也比較高，同時，由于PCR相關反應需要經過DNA的熱變性、長時間的溫度循環等等，耗時較長，從3小時到20小時不等，不利于食品中毒的現場快速診斷和處理，所以目前情況來看，在實驗室研究中應用較多，在食品衛生實際檢驗中由于相對要求比較高，推廣應用上有一定難度。

環介導等溫擴增法（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）是由日本的榮研株式會社的Notomi等人于2000年開發出來的一種新型的核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，60～65℃恒溫擴增，15～60分鐘左右即可核酸擴增，效率可達10⁹～10¹⁰個數量級，具有操作簡單、特異性強、快速靈敏、產物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核酸三磷酸基質中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現白色；或在有鈣黃綠素、SYBR?Green等顏色指示劑存在的情況下，反應產物呈現出特定的顏色。因此，可以把渾濁度或顏色作為反應的指標，只用肉眼觀察到白色渾濁沉淀或特定顏色，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和染色過程。LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，有著廣泛的應用前景。但是，目前尚未見有利用環介導等溫擴增（LAMP）對貝類奧爾森派琴蟲進行檢測的報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種更方便、特異性強、成本低、通過肉眼直接檢測熒光來判斷結果的奧爾森派琴蟲可視化環介導等溫擴增（LAMP）檢測試劑及檢測方法。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：奧爾森派琴蟲可視化環介導等溫擴增檢測試劑，針對奧爾森派琴蟲的5.8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區序列，設計6條特異性LAMP擴增引物，其中包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、兩條環引物LF和LB；所述擴增引物的核苷酸序列分別為：

F3為5'-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3'，

B3為5'-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3'；

FIP為5'-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3'，

BIP為5'-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3'；

LF為5'-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3'，

LB為5'-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3'。

所述的擴增引物加入反應試劑后共同組成LAMP檢測液體系，所述的反應試劑包括反應緩沖液Bst?DNA?polymerase?bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、顏色指示劑。

所述的顏色指示劑為鈣黃綠素和氯化錳，或是SYBR?Green。SYBR?Green是高靈敏的DNA熒光染料，應用于DNA和RNA的檢測，這些試劑可以在市場上購買得到。