[發(fā)明專利]奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110362400.3
• 申請(qǐng)日: 2011-11-16
• 公開（公告）號(hào): CN102363812A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芝勛;龐耀珊;謝麗基;謝志勤;鄧顯文;劉加波;范晴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

1.奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑，其特征在于：針對(duì)奧爾森派琴蟲的5.8S核糖體RNA與內(nèi)轉(zhuǎn)錄2間隔區(qū)序列，設(shè)計(jì)6條特異性LAMP擴(kuò)增引物，其中包括兩條外引物F3和B3、兩條內(nèi)引物FIP和BIP、兩條環(huán)引物L(fēng)F和LB，所述的F3為5'-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3'，所述的B3為5'-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3'，所述的FIP為5'-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3'，所述的BIP為5'-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3'，所述的LF為5'-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3'，所述的LB為5'-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3'。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑，其特征在于：所述的擴(kuò)增引物加入反應(yīng)試劑后共同組成LAMP檢測(cè)液體系，所述的反應(yīng)試劑包括反應(yīng)緩沖液Bst?DNA?polymerase?bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、顏色指示劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑，其特征在于：所述的顏色指示劑為鈣黃綠素和氯化錳，或是SYBR?Green。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑，其特征在于：所述的LAMP檢測(cè)液體系中的各組分濃度分別為：F3?0.1μmol/L～2μmol/L，B3?0.1μmol/L?～2μmol/L，F(xiàn)IP?0.8μmol/L～16μmol/L，BIP?0.8μmol/L～16μmol/L，LF?0.4μmol/L～8μmol/L，LB?0.4μmol/L～8μmol/L，反應(yīng)緩沖液Bst?DNA?polymerase?buffer?1×、鏈置換DNA聚合酶?1U～40U、鎂離子0.6?mmol/L～7?mmol/L、甜菜堿0.1?mmol/L～2?mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs?0.2?mmol/L～2?mmol/L、鈣黃綠素6μmol/L～70μmol/L和氯化錳0.05?mmol/L～1?mmol/L，或1×～10×SYBR?Green代替鈣黃綠素6μmol/L～70μmol/L和氯化錳0.05?mmol/L～1?mmol/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑，其特征在于：所述的LAMP檢測(cè)液體系中的各組分濃度分別為：F3?0.6μmol/L，B3?0.6μmol/L，F(xiàn)IP?4.8μmol/L，BIP?4.8μmol/L，LF?2.4μmol/L，LB?2.4μmol/L，反應(yīng)緩沖液Bst?DNA?polymerase?buffer?1×、鏈置換DNA聚合酶8U、鎂離子4mmol/L、甜菜堿0.2mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs?0.8mmol/L、鈣黃綠素25μmol/L和氯化錳0.25mmol/L，或4×SYBR?Green代替鈣黃綠素25μmol/L和氯化錳0.25mmol/L。

6.一種用權(quán)利要求1～5任一所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，其特征在于：所述檢測(cè)方法的檢測(cè)步驟包括：

(1)提取待檢樣品的基因組DNA；

(2)配制LAMP檢測(cè)液體系；

(3)在LAMP檢測(cè)液體系中加入步驟（1）提取的待檢樣品基因組DNA；

(4)將步驟（3）配制的反應(yīng)體系混合均勻；

(5)將步驟（4）的反應(yīng)體系置于恒溫設(shè)備；

(6)按反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序依次為：?55℃～70℃??30min～120?min，?80℃～100℃??5min，10℃?5min；?

(7)反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)顏色反應(yīng)判斷檢測(cè)結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：肉眼直接觀察或在紫外光下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光的樣品判斷為奧爾森派琴蟲感染陽(yáng)性樣品，反之為陰性樣品。