[發明專利]一種分離培養人腦膜瘤細胞的方法

有效

• 申請號: 201110362126.X
• 申請日: 2011-11-15
• 公開（公告）號: CN103103162A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 宮曄;沙紅英;湯海亮;謝清;鄭名哲;汪戴軍;陳銜城;毛穎;周良輔
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及細胞分離培養方法，具體涉及腦膜瘤細胞分離與培養的方法，尤其涉及一種從離體的人腦膜瘤組織分離和傳代培養腦膜瘤細胞的方法。

背景技術

據報道，腦膜瘤為常見的顱內腫瘤，約占顱內腫瘤總數的20％，其中，女性發病率更高。研究顯示，腦膜瘤多數為良性，其病程長，分布大致與蛛網膜粒的分布情況相似，通常以大腦半球矢狀竇旁為最多。手術切除是首選的臨床治療方法，治療實踐顯示，部分腦膜瘤切除之后5年復發率較高；而部分腫瘤因部位較深或鄰近重要腦部結構，術中很難做到手術全切，其中不能切除的、部分切除、或術后復發的常以放射治療為主。目前臨床不能做手術的和放射治療的病人，其他治療選擇余地很小，已成為神經外科醫師治療腦膜瘤的一大難題。腦膜瘤細胞的體外培養是研究其發病及藥物治療的基礎，但原代及傳代培養人腦膜瘤細胞要比其它腫瘤細胞困難得多，迄今尚未建立起穩定高效的腦膜瘤培養方法。然而，腦膜瘤的臨床前研究依賴于體外細胞模型和體內腫瘤模型的建立，體內模型的建立又依賴于高效率的體外細胞模型的建立，因此建立高效的腦膜瘤體外細胞模型成為研究腦膜瘤的必要手段。據研究報道，腦膜瘤組織細胞在體外很難長期傳代培養，國內外許多學者所進行的腦膜瘤細胞的研究大都以原代細胞為主。國外有研究建立了幾株腦膜瘤細胞株，但其中除了惡性者外，大都進行了基因干預才達到永生化，這樣勢必改變腫瘤細胞原有的特性，故而在這種細胞上研究所獲得的結論不能準確反應體內的信息。因此建立高效的腦膜瘤細胞原代培養和傳代培養體系，對研究其發病機制及開發新的藥物治療方法具有重要意義。

目前，導致難以大量獲得腦膜瘤原代細胞和傳代培養細胞的因素有以下幾方面：(1)腦膜瘤組織細胞間質包括基質/纖維多，采用機械分離或單一酶的方法難以消化腦膜瘤組織，硬性機械分離或酶長時間消化，導致細胞破碎，因此自組織中不能獲得大量活細胞；(2)由于腦膜瘤大多數為良性，細胞生長緩慢，不能爬行到離組織塊較遠的無細胞區生長，只能在組織塊周邊爬出生長。所以細胞很難長滿培養瓶底；(3)由于細胞生長速度較慢，單層細胞貼壁培養時，以常規細胞接種密度接種傳代培養，難以長期傳代下去；(4)未建立一種適合腦膜瘤細胞的培養系統，能促進腦膜瘤細胞增殖的生長因子或激素尚不清楚。

本發明針對上述問題，建立了一套高效分離和傳代培養人腦膜瘤的方法，獲得了大量腦膜瘤細胞，經腦膜瘤特征性標志物波形蛋白(Vimentin)、上皮膜抗原(EMA)表達鑒定，證明所獲得的細胞均為腦膜瘤細胞。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種腦膜瘤細胞分離與培養的方法，尤其是一種從人腦膜瘤組織高效分離培養腦膜瘤原代細胞的方法。

本發明進一步目的是提供一種穩定傳代培養腦膜瘤細胞的方法。

本發明提供了腦膜瘤細胞原代大規模培養及傳代培養的方法，采用雞尾酒式組合酶將人腦膜瘤組織經分步消化法，獲得腦膜瘤細胞懸液，然后在特定的培養液中低氧培養，獲得大量的原代腦膜瘤細胞；這些原代腦膜瘤細胞能在特定培養液及低氧條件下，懸浮培養至15代以上。

本發明中，所述的組合酶包括中性蛋白酶(dispase)、膠原酶(collagenase)、DNA酶(DNase)，所述的組合酶以雞尾酒式配方組成酶消化液；

本發明中，所述的人腦膜瘤組織源于離體的病人腦膜瘤組織；

本發明中，所述的分步消化法包括四步消化，每步消化后獨立收集消化的懸液進行離心收集細胞；

本發明中，所述的特定培養液包括下述組分：DMEM-F12，按1∶50添加B27補劑，20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，20ng/ml表皮生長因子(EGF)，10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、5μg/ml肝素(Heparin)，20nM孕酮(Progesterone)，100mM雄烯二酮(Androstenedione)，50U/ml青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin)。

本發明中，培養過程是采用1-5％O₂，5％CO₂的低氧二氧化碳培養系統。

具體而言，本發明的一種分離培養人腦膜瘤細胞的方法，其特征在于，其包括步驟：

(1)人腦膜瘤原代細胞的分離：采用三種酶成分(dispase、collagenase、DNase)組成的雞尾酒式酶消化液結合機械吹打，分步消化腦膜瘤組織以收集腦膜瘤細胞；