[發明專利]一種分離培養人腦膜瘤細胞的方法

有效

• 申請號: 201110362126.X
• 申請日: 2011-11-15
• 公開（公告）號: CN103103162A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 宮曄;沙紅英;湯海亮;謝清;鄭名哲;汪戴軍;陳銜城;毛穎;周良輔
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種分離培養人腦膜瘤細胞的方法，其特征在于，采用雞尾酒式組合酶將離體的人腦膜瘤組織進行分步消化，獲得腦膜瘤細胞懸液，在特定的培養液中低氧培養，獲得原代腦膜瘤細胞；獲得原代腦膜瘤細胞在特定的培養液及低氧條件下，懸浮培養至15代以上。

2.按權利要求書1所述的方法，其特征在于，該方法包括步驟：

(1)分離人腦膜瘤原代細胞：采用組合酶組成的雞尾酒式酶消化液結合機械吹打，分步消化離體的腦膜瘤組織以收集腦膜瘤細胞；

(2)接種培養人腦膜瘤原代細胞：配制腦膜瘤細胞特定培養液以5×10⁵個/ml接種進行原代細胞懸浮培養，

(3)條件性培養人腦膜瘤原代細胞：當培養液變黃，更換一半新鮮培養液，該一半新鮮培養液與另一半舊的培養液組成條件性培養液，培養條件為37℃，5％CO₂，1-5％O₂；

(4)：傳代培養人腦膜瘤細胞

a.人腦膜瘤細胞的懸浮傳代培養：當細胞球直徑大于200μm時，用TrypLE^TMExpress改良胰酶消化為單細胞后1∶2傳代，培養液為條件性培養液，培養條件為37℃，5％CO₂，1-5％O₂；

b.人腦膜瘤細胞的貼壁傳代培養：當細胞球直徑大于200μm時，用TrypLE^TMExpress消化為單細胞后1∶2傳代，培養液為條件性培養液添加10％FBS，培養條件為37℃，5％CO₂，1-5％O₂；細胞消化傳代采用0.05％的胰酶(Trypsin)，消化后以1∶2傳代接種。

(5)：人腦膜瘤細胞的鑒定

采用vimentin、EMA、巢蛋白(nestin)、微管蛋白(β-tublin)、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、CD31、CD34和CD45指標檢測腦膜瘤細胞體外特征。

3.按權利要求書1或2所述的方法，其特征在于，所述的組合酶包括中性蛋白酶、膠原酶和DNA酶。

4.按權利要求書1或2所述的方法，其特征在于，所述的分步消化包括四步消化，每步消化后獨立收集消化的懸液進行離心收集細胞。

5.按權利要求書1或2所述的方法，其特征在于，所述的特定培養液包括下述組分：DMEM-F12，按1∶50添加B27補劑，20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，20ng/ml表皮生長因子(EGF)，10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、5μg/ml肝素(Heparin)，20nM孕酮(Progesterone)，100mM雄烯二酮(Androstenedione)，50U/ml青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin)。

6.按權利要求書1或2所述的方法，其特征在于，所述培養過程中采用1-5％O₂，5％CO₂的低氧二氧化碳培養系統。

7.按權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述的懸浮培養是指細胞在特定培養液及低氧系統中呈細胞球生長。

8.按權利要求書2所述的方法，其特征在于，所述的貼壁培養是指細胞在特定培養液添加10％血清及低氧系統中呈單層細胞貼壁培養。