[發明專利]一種免疫親和層析介質的制備方法及在純化河豚毒素中的應用

無效

• 申請號: 201110361403.5
• 申請日: 2011-11-15
• 公開（公告）號: CN102407098A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 余勃;馬春燕;陸豫
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/26;B01J20/281;B01J20/30;B01D15/08;C07K1/22
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明屬于生物活性分子的分離純化領域，涉及一種層析材料，具體說是一種用于河豚毒素分離純化的免疫親和層析介質及其應用。

技術背景

河豚毒素(tetrodotoxin，TIX)是一種毒性很強的小分子非蛋白類神經毒素，其可與神經細胞膜的鈉離子通道受體高度特異性的結合，從而阻斷鈉離子通道，抑制神經沖動的傳導。因此，河豚毒素具有出色的神經止痛作用，其麻醉效果比一般麻醉藥強1000倍以上，而且具有不成癮的優點，可取代化學藥物和中草藥用于戒毒。同時，它還具有鎮靜、抗心律失常、預防腎功能衰竭及降血壓等作用，因而具有很大的藥用開發價值。雖然河豚毒素具有極強的醫療效果，但其提取工藝極其復雜、純品的產量極低，目前只有美國、日本﹑中國等少數幾個國家有研究和生產的報道，而在國際市場上高純度的河豚毒素每克價格高達18-20萬美金。

目前在制備河豚毒素工藝中涉及到的分離純化方法主要有：活性炭吸附法、大孔樹脂吸附層析、離子交換層析、凝膠層析等。此類方法如單獨使用都存在分離特異性差、回收率不高、產率較低等缺陷。通常是采用多種方法聯用的策略，但這同時又會帶來分離步驟過于繁瑣，目標產物損失過大，消耗大量洗脫試劑等新問題。另有報道利用超濾方法對河豚毒素進行純化的，但河豚毒素是一個分子量只有319道爾頓的小分子，使用超濾必須使用截留分子量小于500的超濾膜才能起到一定的分離效果，但仍難以將河豚毒素和分子量與之接近的鹽類很好的分離，同時超濾法對儀器設備要求極高。目前還有報道利用C₁₈固相萃取小柱來純化河豚毒素，此方法分離步驟少，但C₁₈固相萃取柱的介質對河豚毒素的分離特異性較低，分離到的河豚毒素達不到標準品純度，而且C₁₈固相萃取小柱價格高且每次處理量較少。因此，有必要對傳統的河豚毒素分離純化模式和工藝進行創新和改進。

免疫親和層析（immune?affinity?chromatography，IAC）是一種利用抗體與抗原之間存在高度特異性的親和力而發生特異性、可逆性結合的原理，從多組分的混合物中分離特定抗原或抗體的一種層析技術。目前，該方法在抗體、激素、多肽及小分子化合物的分離純化和分析檢測中被廣泛應用。雖然免疫親和技術在上世紀80年代開始在分離純化領域得到逐步應用，但利用免疫親和層析來分離純化河豚毒素尚未見報道，更無商品化的河豚毒素免疫親和層析（介質）柱出售。

發明內容

本發明的目的是提供一種可用于河豚毒素分離純化的免疫親和層析介質。所述免疫親和介質是由經活化后的固相載體與河豚毒素特異性抗體偶聯而成。利用本發明所述免疫親和介質填料裝柱可制備成相應免疫親和色譜柱，用于河豚毒素的分離純化。

1、河豚毒素免疫親和層析介質的制備。

本發明所述的免疫親和介質是由經活化的固相載體與河豚毒素特異性抗體偶聯而成。

（1）先將固相載體經溴化氰法（CNBr）活化。

（2）取河豚毒素特異性抗體與溶脹后的活化固相載體（濕凝膠）置于pH?6.0-7.5，0.1-0.5?mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液中在室溫下振蕩偶聯，其中抗體與溶脹后的活化固相載體的質量比為1:?100。

（3）將上述偶聯凝膠產物轉入其5-10?倍體積的pH?6.0-7.5，含有0.1-0.5?mol/L?醋酸的Tris-HCl緩沖液中，室溫下振蕩反應2?h進行封閉；最后用5-10?倍于封閉后凝膠體積的pH?6.0-7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌2-4?次。

本發明所述的固相載體可為交聯葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Gel?P）、交聯瓊脂糖（Sepharose）、多孔玻璃等。優選為交聯瓊脂糖（Sepharose?CL-2B）。

本發明所述的河豚毒素特異性抗體是通過河豚毒素與載體蛋白的偶聯物為免疫原來免疫動物得到的。其具體獲得有兩種途徑：1、根據免疫學方法和程序自主制備；2、直接購買商品化河豚毒素特異性抗體。

2、利用本發明所提供免疫親和層析介質制備成色譜柱用于河豚毒素純化的方法，包括以下步驟。

（1）含有河豚毒素的樣品前處理。

（2）河豚毒素免疫親和層析柱的制備。

將得到的免疫親和介質填充入固相萃取柱中，加入pH?6.0-7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液后自然沉降，制成河豚毒素特異性抗體免疫親和柱，于4℃保存待用。