[發明專利]一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法

有效

• 申請號: 201110361034.X
• 申請日: 2011-11-15
• 公開（公告）號: CN102391374A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 任偉業
• 申請（專利權）人: 無錫貝迪生物工程有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 張水俤

技術領域

本發明涉及一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法，屬于蛋白質工程領域，該產品為保持三螺旋結構的活性膠原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，適用于醫療用途。

背景技術

膠原是脊椎動物體內含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白，分子量約為300000，均可在細胞外形成超分子聚集物，大量存在于骨、軟骨、肌腱及皮膚中，占人體或其他動物體總蛋白含量的25％-33％。同一組織中常含有幾種類型的膠原，常以某種為主。I型膠原遍布于肌體的各部分，主要為皮膚、肌腱及韌帶中，具有很強的抗張能力。II型膠原主要存在于透明軟骨、玻璃體中，具有較強的抗壓能力。III型膠原廣泛分布于伸展性大的組織中，如疏松結締組織等，具有伸展性及應變性。其中，I型膠原占生物體總膠原量的90％，因此，I型膠原在生物材料中的使用也最廣泛。

膠原在分子水平結構相同，由3條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型。3條左手螺旋鏈又相互纏繞成右手螺旋結構，即超螺旋結構為膠原蛋白獨特的三重螺旋結構，使其分子結構非常穩定。3條鏈富含甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，酪氨酸含量也很低，但含獨特的羥化氨基酸(羥脯氨酸和羥賴氨酸)。由于原纖維的方向性和成束直徑及密度的不同，不同組織的膠原存在結構差異，并具有各自的功能和結構特征。在結締組織中，膠原除了機械支撐外，還是細胞粘附和移動的重要物質基礎，因此，膠原被認為是胚胎發育和組織再生中重要的形態發生因素，在組織工程中得到廣泛應用。

能被稱為膠原的，必須是其三螺旋結構沒有改變的那類蛋白質，還保留有完全生物活性。而膠原蛋白是膠原的水解產物，膠原的三螺旋結構徹底松開，成為3條自由的肽鏈，且降解成多分散的肽段，其中包括小肽。因此膠原蛋白是多肽混合物，相對分子量從幾千到幾萬，分子量分布很寬，沒有生物活性，能溶于冷水，而且能被蛋白酶利用。

CN1110284中公開了一種膠原的制備方法，以酸提取，鹽沉淀，膜過濾，最后凍干，其提取效率和純度都較低。CN101250218公開了一種以鱈魚皮為原料制備膠原蛋白的方法，其制備方法會破壞膠原的三螺旋結構。現有技術公開的方法在膠原的提取制備過程中往往破壞膠原的三螺旋結構，或者提取效率較低，無法實現既能夠保留活性膠原的三螺旋結構，又同時提高提取效率和純度。

發明內容

針對上述情況，本發明的目的是提供一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法。本發明使用酸酶結合處理加漸進式超聲波處理的制備方法，不僅能夠保持膠原的三螺旋結構，同時顯著的提高了膠原的提取效率。本發明使用H₂O₂溶液處理加酸溶鹽析純化加透析純化有效的提高了膠原產品的純度。

一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法，包括如下步驟：原料預處理、除脂、酸酶結合處理、超聲波處理、H₂O₂溶液處理、酸溶鹽析純化、透析純化、干燥。

所述的原料為選自新鮮豬皮、牛皮、牛跟腱中的一種。

所述的酸酶結合處理為：經過預處理的原料浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌25～30小時左右。

所述的超聲波處理優選采用漸進式超聲波處理，先使用100～200W超聲處理30分鐘，再使用200～300W超聲處理30分鐘，最后使用300～400W超聲處理1小時。

所述的一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法，具體步驟如下：

(1)取新鮮豬皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質，清洗，將豬皮破碎成小顆粒狀，按照固液比1∶30～1∶40的比例，加入0.01～0.03mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6～8℃浸泡1～2小時，過濾，備用；

(2)在上述預處理后的豬皮中加入質量為豬皮質量6～8倍的無水乙醚或者丙酮，于35～40℃回流5-8小時，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；

(3)將上述豬皮浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌25～30小時左右；

(4)對上述混合物采用漸進式超聲波處理，先使用100～200W超聲處理30分鐘，再使用200～300W超聲處理30分鐘，最后使用300～400W超聲處理1小時；

(5)加入2～3％的H2O2溶液，混合靜置2～4小時，調節pH至5.0，離心；