[發明專利]滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法

有效

• 申請號: 201110360064.9
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN103102409A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 紀向陽
• 申請（專利權）人: 上海楓華制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12N7/04
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪

技術領域

本發明涉及一種藥用生物制品制備方法，尤其涉及一種將從人尿提取的胰蛋白酶抑制劑中所含病毒滅活的方法。

背景技術

人尿胰蛋白酶抑制劑(human?Urinary?Trypsin?Inhibitor，hUTI)是一種從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的糖蛋白，由143個氨基酸組成，SDS-PAGE測得的相對分子質量范圍40kDa-45kDa(Eur.J.Biochem.，158，417-422)。其屬于蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶和纖溶酶等多種酶具有抑制作用。此外，其還具有穩定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子(MDF)產生，清除氧自由基及抑制炎癥介質釋放的作用。人尿胰蛋白酶抑制劑還可改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，治療關節炎，治療嚴重急性呼吸綜合征，防止手術刺激引起的對內臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環狀態等(CN102205115A、CN101024075A、CN1751740A、CN1449823A、CN101837121A、CN101954072A、CN101954071A、CN101972471A、CN101020048A和CN101095948A)。

對于人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化的研究已開展幾十年，已知的這些純化方法有陰離子交換色譜、金屬螯合樹脂分離、超濾、凝膠過濾、親和性色譜、無機吸附劑處理、鹽析、等電點沉淀法、脫乙酰殼多糖吸附和不溶性胰蛋白酶處理等(特開昭51-51579、特開昭51-118810、特開昭51-123810、特開昭55-160724、特開昭56-99427、特開昭57-140728、特開昭60-260518、特開昭61-37736和特開平5-9200)。中國發明專利ZL?200610000200.2和ZL?200610000601.8在特開平5-9200所公開技術的基礎上分別提供了一種獲得高純度烏司他丁的方法，所得烏司他丁濃度為5萬單位/ml時，在405nm處光吸收值不超過0.2，人尿激肽原酶含量不超過0.0005PNAU，抑制胰蛋白酶的活性不低于3500單位/mg蛋白(凱氏定氮法測定蛋白含量)。

由于人尿胰蛋白酶抑制劑一般從新鮮人尿中分離提取而得，具有被病毒污染的潛在風險。前述這些研究大都集中于對人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化，但是對于其中所可能含有的病毒(如：人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒、水皰性口炎病毒和肝炎病毒等)去除方面所給予的關注較少。特開昭61-37736公開了一種去除人尿胰蛋白酶抑制劑中所含肝炎病毒的方法，該方法采用在pH2-8(尤以3-5為佳)溶液中60℃加熱處理10小時，去除混雜在原料中的病原性肝炎病毒。其結果表明經過10小時60℃加熱處理，人尿胰蛋白酶抑制劑在酸性下穩定，而在pH8以上的堿性則表現出不穩定。

除了熱處理法(包括干熱處理、蒸汽處理和巴斯德加熱處理法)以外，其它方法如：有機溶劑/表面活性劑(S/D)處理法、胃蛋白酶處理方法、紫外線照射處理方法、低pH孵化法、納米膜過濾法和低溫乙醇分離法等也可被用于病毒滅活。周錫鵬等人驗證了人尿胰蛋白酶抑制劑生產工藝中采用的60℃水浴10小時和乙醇處理3小時的病毒滅活方法(中國生化藥物雜志[J]，2009，6，407-410)，雖然具有較好的滅活效果，但有機溶劑(乙醇)會殘留在終產品中，進而影響用藥的安全。

雖然現有技術已在滅活人尿胰蛋白酶抑制劑所含病毒方面進行了初步研究，但是這些技術或適用于滅活肝炎病毒，或仍對用藥安全性產生影響。

發明內容

本發明的目的在于提供一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，通過綜合運用多種病毒滅活方法，不斷調整滅活條件和其它手段相配合，進一步提高病毒的滅活效果。

本發明的另一個目的在于提供一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，與人尿胰蛋白酶抑制劑的分離純化過程相配合，在分離過程中實現病毒的滅活。

本發明提供的一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下：