[發明專利]滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法

有效

• 申請號: 201110360064.9
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN103102409A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 紀向陽
• 申請（專利權）人: 上海楓華制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12N7/04
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪

1.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下：

將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，并于60℃加熱10小時，然后吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用1M硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經超濾后，于25℃，低pH孵化5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。

2.根據權利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于吸附于DEAE層析柱所用的緩沖液為pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液。

3.根據權利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述低pH孵化采用pH為1.5-4.5。

4.根據權利要求1所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述超濾所用的超濾膜分子量為10K。

5.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下：

將從人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為，并于60℃加熱10小時，然后將所述溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用1M硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經超濾10K后，于25℃，pH2.5-3.5條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。

6.根據權利要求1或5所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述人尿胰蛋白酶抑制劑粗品的配置濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液。

7.一種滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其主要步驟如下：

1)將新鮮收集的尿液傾入攪拌池中，邊攪拌，邊將pH調至8.5-9.0，靜置后取上清尿液；

2)調節所述上清尿液pH至4.5-6.5后，按每噸所述上清尿液加入25kg脫乙酰殼多糖，邊加邊攪拌，靜置后取沉淀，并濾干得吸附物。

3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并濾干，重復2次以上；

4)每千克所述吸附物加入1.0-2.0升pH為10.5-12.0的3N氨水溶液，洗脫所述吸附物，并收集氨水洗脫液；

5)根據按每升所述氨水洗脫液加入400g-450g固體硫酸銨，至全部溶解，靜置過夜；

6)以硅藻土作底，抽濾，即得抽濾物；

7)每公斤所述抽濾物加入10升水溶解，將pH調至5.5-6.5后，離心，取上清液；

8)所述上清液用10K超濾膜，得超濾濃縮液；

9)每升所述超濾濃縮液加入1倍體積無水乙醇沉淀，并靜置過夜；之后取下層混懸液離心，得清液，再加入和所述清液相同體積的無水乙醇沉淀，并靜置過夜；再取下層混懸液離心，將沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制劑粗品；

10)將從人尿中提取的所述人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解于pH5.0緩沖液，制成濃度為50mg/ml-100mg/ml的溶液，并于60℃加熱10小時，然后將所述溶液于pH4.0含NaCl濃度為0.1M的0.1M醋酸緩沖液中上樣，并吸附于DEAE層析柱，之后使用pH4.0含NaCl濃度為0.3M的0.1M醋酸緩沖液洗脫，得DEAE洗脫液；接著將所述DEAE洗脫液于1.5M-2.5M硫酸銨溶液上樣，并吸附于疏水層析柱，之后使用1M硫酸銨溶液洗脫，得疏水洗脫液；所述疏水洗脫液經10K膜超濾后，于25℃，pH2.5-3.5條件5小時后，再經凝膠過濾層析得病毒滅活的人尿胰蛋白酶抑制劑。

8.根據權利要求1、5和7之一所述的滅活人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑所含病毒的方法，其特征在于所述病毒為人免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、偽狂犬病毒、水皰性口炎病毒和肝炎病毒之一種或幾種。