[發明專利]單核細胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測試劑及應用

有效

• 申請號: 201110359470.3
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102363811A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 孟慶玲;喬軍;陳創夫;丁波;張再超;田振中;蔡擴軍;楊麗紅
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所 65102
• 代理人: 朱永慧

技術領域

本發明涉及一種能夠鑒別單核細胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產的分子檢測技術，特別是提供了能夠用于鑒別單核細胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產的分子檢測試劑及其制備方法和應用，屬于動物性食品病原學檢測技術領域。?

背景技術

懷孕母畜流產是獸醫臨床中最常見的疾病。在畜牧業生產實踐中，引起母牛母羊流產的誘因很多，主要有遺傳、氣候與環境、內分泌、微生物和飼養管理等因素，其中由病原微生物引起的流產是重要的誘因。單核細胞增生李斯特菌（Listeria?monocytogenes，LM）是一種能引起人和動物李斯特菌病的人獸共患病原菌。自從1926年首次分離到該菌以來，目前已證實該菌可感染綿羊、山羊、牛、豬、鹿、雞、兔、鼠、鴨、鵝、鸚鵡、北極狐等40多種動物。在家畜上，LM可引起腦膜腦炎、流產和急性敗血病；在家禽上，LM可導致敗血癥和心肌壞死的發生，每年該病都對我國畜禽養殖業造成較大的經濟損失。同時，作為一種重要的食源性細菌，該菌能污染肉、奶、蛋等動物性食品而引起食品中毒，并能導致孕婦、新生兒及免疫力低下的成年人發病，對人類的健康也構成極大的威脅，被列為是四大食源性病原菌之一。胎兒彎桿菌(Campylobacter?fetus)是引起牛羊流產的重要病原之一。該菌屬于彎桿菌屬的成員，包括胎兒彎桿菌胎兒亞種(C.?fetus?subsp.?fetus)和胎兒彎桿菌性病亞種(C.?fetus?subsp.venerealis)。胎兒彎桿菌可感染人，尤其患有免疫缺陷癥的人，感染后能引起腦膜炎、菌血癥、關節炎、腹瀉等疾病。因此，胎兒彎桿菌嚴重威脅著人類的健康并給畜牧業造成重大經濟損失。

近年來，由單核細胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌感染導致的牛羊流產病例日益增多，在畜牧業生產上根據臨床癥狀無法鑒別上述兩種細菌感染引起的流產。目前，國內對于單核細胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌病的診斷方法主要依賴于病原的分離、生化實驗等常規方法，但由于胎兒彎桿菌的生長需要嚴格的氣體環境和生化條件，而且對采集的病料有特殊要求，一般的實驗室不具培養條件，特別是胎兒彎桿菌在合適的培養基上也生長緩慢，得到了可疑菌落，用生化試驗來鑒定胎兒彎桿菌難度仍然較大。這給胎兒彎桿菌的分離帶來很大困難；單核細胞增生李斯特菌培養法雖然準確，但制備培養基、計算菌落數量和鑒定菌落的生化特性都耗時耗力，并且培養方法的成功依賴于樣本中細菌的數量和狀況和培養基選擇，不適合當前快速檢測的需求。對單核細胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌免疫學方法包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和酶聯熒光分析法（ELFA）。ELISA法雖然敏感性較高，但其缺點當檢測樣品受污染時特異性較差；ELFA法雖然特異性和敏感性都較高，但該方法的缺點是成本較高。

鑒于單核細胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌常規檢測方法存在一定的不足，目前迫切需要研究能快速鑒別單核細胞增生李斯特菌與胎兒彎桿菌性流產的分子檢測試劑和方法。近年來，隨著分子細菌學的快速發展，檢測單核細胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌的分子生物學技術也逐漸建立起來。與常規細菌培養法和免疫學方法相比，分子生物學技術在檢測單核細胞增生李斯特菌方面具有快速、特異、敏感和準確等優勢。內化素J（InlJ）基因是存在于單核細胞增生李斯特菌基因組中的保守基因，而16S?rDNA基因在胎兒彎桿菌基因組中也高度保守。因此，根據兩種細菌的保守基因可以設計和合成針對兩種細菌的特異性的分子檢測試劑，用于檢測并鑒別上述兩種細菌引起的牛羊流產。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用單核細胞增生李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16S?rDNA基因高度保守序列設計合成了2對用于鑒別上述兩種細菌的分子檢測試劑。

本發明的另一目的是提供一種簡單實用、易操作的上述檢測試劑的制備方法。

本發明的再一目的是提供一種快速、特異性強、敏感性高、重復性好，應用上述分子檢測試劑建立的檢測單核細胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌并能鑒別兩菌的二聯PCR檢測應用方法。

本發明公開了一種單核細胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測試劑，其特征在于包含能擴增單核細胞增生性李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16S?rDNA基因的2對特異性引物，?其中P1和P2引物擴增InlJ基因片段，擴增長度為320?bp；P3和P4引物擴增胎兒彎桿菌16S?rDNA基因片段，擴增長度為763?bp；所述引物序列為：

P1：<210>1；

P2：<210>2；

P3：<210>3；