[發(fā)明專利]單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測(cè)試劑及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110359470.3
• 申請(qǐng)日: 2011-11-14
• 公開（公告）號(hào): CN102363811A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟慶玲;喬軍;陳創(chuàng)夫;丁波;張?jiān)俪?/a>;田振中;蔡擴(kuò)軍;楊麗紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 石河子大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務(wù)所 65102
• 代理人: 朱永慧

1.?一種單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌的檢測(cè)試劑，其特征在于包含能擴(kuò)增單核細(xì)胞增生性李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16S?rDNA基因的2對(duì)特異性引物，?其中P1和P2引物擴(kuò)增InlJ基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為320?bp；P3和P4引物擴(kuò)增胎兒彎桿菌16S?rDNA基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為763?bp；所述引物序列為：

P1：<210>1；

P2：<210>2；

P3：<210>3；

P4:??<210>4。

2.一種單核細(xì)胞增生性李斯特菌與胎兒彎桿菌檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于主要包括以下步驟：

（1）、單核細(xì)胞增生李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16S?rDNA基因保守序列的選擇：從DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已經(jīng)公布的單核細(xì)胞增生李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16S?rDNA基因序列，分別用基因序列分析軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選擇兩個(gè)基因高度保守的靶序列，其中單核細(xì)胞增生李斯特菌InlJ基因擴(kuò)增的靶序列為：<210>5；胎兒彎桿菌16S?rDNA基因擴(kuò)增的靶序列為：<210>6；

（2）、特異性引物的設(shè)計(jì)及合成：

根據(jù)選擇的單核細(xì)胞增生李斯特菌InlJ基因和胎兒彎桿菌16S?rDNA基因的靶序列，用PCR引物設(shè)計(jì)軟件分別進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行最佳配對(duì)篩選試驗(yàn)，得到2對(duì)最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行引物的合成，其中P1和P2引物擴(kuò)增InlJ基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為320?bp,P3和P4引物擴(kuò)增胎兒彎桿菌16S?rDNA基因片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為763?bp，所述引物序列為：

P1：<210>1；

P2：<210>2；

P3：<210>3；

P4:?<210>4。

3.一種單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測(cè)試劑的應(yīng)用方法，其特征在于主要包括以下步驟：

（1）、樣品的處理：

取一定量的流產(chǎn)胎兒或胎盤病料，先用剪刀將其剪碎，再研磨至糊狀，滅菌，倒入Eppendorf管中，置于冰上待用；

（2）、病料樣品DNA的提?。?

（3）、二聯(lián)PCR反應(yīng)：

采用50?μL?PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系的組成為：10×PCR緩沖液5μL，25mmol/L?MgCl₂?5μL，2.5mmol/L?dNTP?4μL，P1、P2?、P3、和P4（25pmol/μL）各1μL，病料樣品中提取的DNA?2?～6?μL，Taq?DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，補(bǔ)加去離子水至50?μL；最佳循環(huán)參數(shù)均為96℃，150?s；94℃，40?s；72℃，80?s；52℃，50?s，最后72℃延伸10min；

（4）、?結(jié)果判定：

取二聯(lián)PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上，電泳后并用溴化乙錠染色，然后在紫外光透射儀下觀察拍照，以標(biāo)準(zhǔn)DNA?marker?（D,L-2000）作參考，若電泳后，若瓊脂糖凝膠中同時(shí)出現(xiàn)2條核酸帶，其中一條片段大小為320?bp，另一條片段大小為763?bp，說(shuō)明病料樣品中同時(shí)含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌；如果僅出現(xiàn)320?bp大小的核酸片段，則表明病料樣品中含有單核細(xì)胞增生李斯特菌；如果僅出現(xiàn)763?bp大小的核酸片段，則表明病料樣品中含有胎兒彎桿菌；若不出現(xiàn)任何核酸片段，則表明病料樣品中不含有單核細(xì)胞增生李斯特菌和胎兒彎桿菌。

4.如權(quán)利要求3所述的單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測(cè)試劑的應(yīng)用方法，其特征在于步驟（1）中樣品的處理主要過(guò)程如下：取一定量的流產(chǎn)胎兒或胎盤病料，先用剪刀將其剪碎，再用試管式研磨器用力研磨至糊狀，加適量的滅菌的PBS，倒入1.5mL的Eppendorf管中，置于冰上待用。