[發明專利]牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑和制備及應用方法

無效

• 申請號: 201110359424.3
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102367491A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 孟慶玲;喬軍;陳創夫;張再超;蔡擴軍;田振中;王俊偉;王為升;楊麗紅
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所 65102
• 代理人: 朱永慧

技術領域

本發明涉及一種能快速檢測是否被牛輪狀病毒與牛冠狀病毒感染的分子檢測技術，特別是提供了不僅能夠分別用于檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的分子檢測，還可以用于同時檢測上述兩種病毒的分子檢測試劑的制備及其應用，屬于動物疫病檢測技術領域。?

背景技術

牛腹瀉病是養牛業中最常見疾病之一，主要以拉稀便、軟便或水樣便，嘔吐、脫水和體重減輕為主要臨床特征。對于犢牛，腹瀉可導致新生犢牛生長發育不良和大量死亡，又被稱為新生犢牛的殺手。致命的腹瀉多侵害生后2周內的犢牛，發病率可達80%，病死率最高可達70%，給養牛業造成巨大的經濟損失。因此，如何預防牛腹瀉病已成為養牛業的迫切需要解決的重要問題。

根據腹瀉發生病因的不同，腹瀉可分為傳染性腹瀉和非傳染性腹瀉。傳染性腹瀉是目前大多數養牛場最常見的疾病，而牛輪狀病毒（Bovine?rotavirus,?BRV）和牛冠狀病毒（Bovine?coronavirus，BCoV?）是牛發生傳染性腹瀉的兩種重要病原。BRV可引起1～3月齡犢牛和成年嚴重腹瀉，在我國的發病率為60%?～?80%，給養牛業造成很大經濟損失。BCoV是引起10日齡新生犢牛腹瀉的一種重要的病原。自美國Mebus等首次報道BCoV以來，隨后證明BCoV在世界范圍內廣泛分布，在我國許多地區牛群中流行。BCoV引起的犢牛腹瀉僅次于輪狀病毒，并且可導致人的腹瀉。

BRV屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，病毒基因組為分節段的單股RNA。BRV基因組含有11個片段，共編碼6個結構蛋白(VPl～VP4，VP6和VP7)和6個非結構蛋白(NSPl～NSP6)。VP7蛋白由基因片段7、8或9編碼，分子量為37Da，由326個AA組成，占病毒蛋白的30％。VP7是BRV外殼的主要糖蛋白和保護性抗原，決定了病毒的G型（C-serotype）。目前已知輪狀病毒有16個C型，在牛群中有10血清型被發現，分別為：Gl-G3、G5-G8、G10、G12、G15，其中在全球范圍內G6、G10和G8較流行，而我國G10株流行廣泛。

BCoV屬牛冠狀病毒科血清II群成員，病毒基因組為不分節段的單股正鏈RNA。BCoV基因組5’端有帽子結構，3’端有poly(A)尾，中間包含約10個ORFs，編碼約8種蛋白。其中編碼的5種結構蛋白，分別為纖突蛋白（Spike?protein,?S）、膜蛋白（Membrane?protein,?M）、血凝素-酯酶（Hemagglutinin-esterase,?HE）、小膜蛋白（Small?membrane?protein,?SM或E）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid?protein,?N）。S蛋白是BCoV的主要保護性抗原，能誘導機體產生具有保護能力的中和抗體。在5種結構蛋白中，N蛋白保守性最高。

目前，檢測BRV和BCoV常用的實驗室方法包括病毒分離法、電鏡觀察、ELISA等。雖然敏感性和特異性較高，但費時費力；ELISA法雖然敏感性較高，但其缺點是當檢測樣品存在污染時特異性較差；而且上述方法通過一次試驗只能檢測一種病原，對這兩種病原的混合感染無法進行。隨著分子生物學的發展，核酸探針和RT-PCR也逐漸建立起來。RT-PCR方法可以針對不同的靶序列進行快速、準確的診斷，在國內外得到了廣泛應用。?

發明內容

?本發明的目的之一在于提供一種利用牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因保守序列設計合成了2對既能夠分別完成又同時完成檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒分子檢測試劑。

本發明的另一目的是提供了上述檢測試劑的制備方法。

本發明的再一目的是利用上述分子檢測試劑建立能夠快速便捷、具有良好的特異性和敏感性及重復性、可分別或同時檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的聯合RT-PCR檢測應用方法。

本發明公開了一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑，其特征在于包含能擴增牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因的2對特異性引物，?其中一對是P1和P2引物擴增牛輪狀病毒VP7基因片段，擴增長度為519?bp；另一對P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879?bp；引物序列為：

P1：?<210>1；

P2：?<210>2；

P3：?<210>3；

P4：?<210>4。

一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的制備方法，其特征在于主要包括以下步驟：