[發明專利]牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑和制備及應用方法

無效

• 申請號: 201110359424.3
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102367491A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 孟慶玲;喬軍;陳創夫;張再超;蔡擴軍;田振中;王俊偉;王為升;楊麗紅
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所 65102
• 代理人: 朱永慧

1.一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑，其特征在于包含能擴增牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因的2對特異性引物，?其中一對是P1和P2引物擴增牛輪狀病毒VP7基因片段，擴增長度為519?bp；另一對P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879?bp；引物序列為：

P1：?<210>1；

P2：?<210>2；

P3：?<210>3；

P4：?<210>4。

2.一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的制備方法，其特征在于主要包括以下步驟：

（1）、牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因保守序列的選擇：從DNA序列數據庫中下載已經公布的牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因序列，分別用基因序列分析軟件進行序列比對，選擇兩個基因保守的靶序列，其中牛輪狀病毒VP7基因擴增的靶序列（519?bp）為：<210>5；其中牛冠狀病毒N基因擴增的靶序列（879bp）為：<210>6；

（2）、特異性引物的設計及合成：

根據上述選擇的牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因的靶序列，用PCR引物設計軟件分別進行引物的設計，將設計的引物進行最佳配對篩選試驗，得到2對最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自動DNA合成儀進行引物的合成，P1和P2引物擴增牛輪狀病毒VP7基因片段，擴增長度為519?bp；P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879?bp，所述引物序列為：

P1：?<210>1；

P2：?<210>2；

P3：?<210>3；

P4：?<210>4。

3.一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于主要包括以下步驟：

（1）、樣品的處理：

糞便樣品的處理，取腹瀉牛糞便，滅菌，離心，取離心液上清加入Eppendorf管中，置于冰上待用；

（2）、糞便樣品中RNA的提取；

（3）、聯合RT-PCR反應：

采用50μL?PCR反應體系，反應體系的組成為：10×PCR緩沖液5μL，25mmol/L?MgCl₂?5μL，2.5mmol/L?dNTP?4μL，P1、P2?、P3、和P4（25pmol/μL）各1μL，RT?產物?2?～6?μL，Taq?DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，補加去離子水至50?μL，最佳循環參數均為96℃，150?s；94℃，40?s；72℃，80?s；52℃，50?s，最后72℃延伸10min；

（4）、?結果判定：

取聯合RT-PCR產物在瓊脂糖凝膠上，電泳，用溴化乙錠染色，然后在紫外光透射儀下觀察拍照，以標準DNA?marker?（D,L-2000，標準分子大小2000、1000、750、500、200、100）作參考，若電泳后，若瓊脂糖凝膠中同時出現2條核酸帶，其中一條片段大小約為519?bp，另一條片段大小約為879?bp，說明樣品中同時含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒；如果僅出現519?bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛輪狀病毒；如果僅出現879?bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛冠狀病毒；若不出現任何核酸片段，則表明樣品中不含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒。

4.如權利要求3所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟（1）樣品的處理中具體步驟為：取腹瀉牛糞便，加入10mL離心管中，根據樣品的稀稠，加適量的滅菌的PBS，攪勻，然后12000r/min離心8min；取離心液上清1?mL加入滅菌的1.5mL的Eppendorf管中，置于冰上待用。