[發明專利]過表達單一MicroRNA成熟體序列的新方法

有效

• 申請號: 201110359200.2
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN103103189A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 沈南;曲波
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及過表達單一MicroRNA成熟體序列的新方法。

背景技術

microRNA是一類長約22個堿基的、廣泛存在于動植物體內的內源非編碼RNA[1]。近10年來，隨著對microRNA研究的不斷深入，科學家們已經發現microRNA雖然不編碼蛋白，但是，它們可以通過堿基互補配對的方式來識別與之相對應的靶mRNA，通過抑制翻譯或是促使靶mRNA降解的方式影響基因表達[2]。microRNA能夠參與諸如生長發育、免疫防御等許多生理過程，并且microRNA的調節異常可以參與到多個疾病的病理過程[3，4]。所以，microRNA作為一種新發現的基因表達調控分子有著重要的功能。

過表達所要研究的目的基因，并觀察其產生的表型，是探索基因功能的一個不可或缺的方法。對于microRNA，過表達的方式目前主要有：轉染人工合成的microRNA類似物或microRNA莖環前體；克隆基因組中的microRNA編碼序列到過表達載體中再轉染細胞。人工合成的類似物或是前體雖然可以特異性地提高細胞中的某個microRNA的表達，但是，它只能實現瞬時表達，隨著細胞的增殖，其過表達水平會被稀釋，難以應用到需要長時間穩定表達的研究，更難以實現體內研究。通過質粒過表達的方式，尤其是通過病毒載體進行的過表達，可以實現穩定過表達，并且轉染容易，能實現體內功能的研究。

但是，目前的microRNA過表達質粒的構建，依賴于克隆基因組中的microRNA編碼序列(通常將pre-microRNA的全部序列同其上下游各一、兩百個堿基一并克隆)。每個microRNA基因經過轉錄、加工，理論上最終都能夠產生兩種具有不同成熟序列的成熟體microRNA：5p-microRNA和3p-microRNA[5]。在生理條件下，對不同的microRNA，這兩種成熟序列會以其中的一種為主進行表達(稱為miR-X)，而另外的一種卻被淘汰降解豐度很低(稱為miR-X^*)；有時則會兩種序列共同表達并存在(分別稱為miR-X-5p和miR-X-3p)[6]。由于現有的質粒過表達策略是模擬細胞內部的microRNA轉錄和成熟的過程，而這一過程對成熟體序列有天然的選擇性，所以，不能大量地過表達水平低的miR-X^*，也不能隨心所欲地單一過表達其中的一條成熟體序列(針對miR-X-5p和miR-X-3p的情況)。

然而，隨著研究深入，microRNA的功能不僅局限于早期所鑒定的表達量豐富的成熟體序列，有越來越多的研究表明，原來被認為表達豐度低的成熟體序列，在特定的條件下表達會被上調，進而發揮調節功能[7，8]。同時，由于5p-microRNA和3p-microRNA的序列差異，其功能往往是不同的。

因此，在原有質粒過表達優勢的基礎上，通過新的策略，單一地過表達microRNA成熟體序列中的一種，勢必為今后更精細的研究microRNA的功能提供了一個強有力的工具。

發明內容

本發明的目的在于提供過表達單一MicroRNA成熟體序列的新方法。

在本發明的第一方面，提供一種表達單一microRNA成熟體的方法，所述方法包括：

(1)提供一種表達構建物，所述的表達構建物含有以下結構：

5’Seq_正向-Y-Seq_反向3’????(I)；

其中，Seq_反向為該單一microRNA成熟體相應的DNA序列；Seq_正向為與Seq_反向互補的序列；Y為位于Seq_正向和Seq_反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq_正向和Seq_反向不互補；式I所示的結構可形成如下所示的二級結構：

其中，“|”表示在Seq_正向和Seq_反向中，相應的核苷酸是配對的，在Seq_正向和Seq_反向之間形成氫鍵；表示在Seq_正向和Seq_反向中，相應的核苷酸不配對；并且，“|”和的分布構成了Seq_反向與Seq_正向的互補；