[發(fā)明專利]一種人二倍體細(xì)胞乙型腦炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110359146.1
• 申請(qǐng)日: 2011-11-14
• 公開（公告）號(hào): CN102406927A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙志鵬;侯文禮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都康華生物制品有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;A61P31/14;C12N7/00
• 代理公司: 四川省成都市天策商標(biāo)專利事務(wù)所 51213
• 代理人: 劉興亮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種乙型腦炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

乙型腦炎主要是由三帶喙庫(kù)蚊叮咬傳播，病毒通過(guò)蚊蟲叮咬進(jìn)入人體內(nèi)首先在局部組織和淋巴結(jié)復(fù)制，擴(kuò)散至其他部位進(jìn)一步復(fù)制后產(chǎn)生病毒血癥，在機(jī)體免疫力低下或某些腦組織損傷的情況下病毒通過(guò)血-腦脊液屏障，侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)生腦炎。一旦發(fā)病，該病的病死率和愈后后遺癥的比例較高。目前，預(yù)防性接種疫苗是防治該病的有效手段。

目前，市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的主要有鼠腦純化滅活疫苗，地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗，乙型腦炎減毒活疫苗及Vero細(xì)胞滅活疫苗四種疫苗。鼠腦純化滅活疫苗是將病毒接種感染小鼠后取其腦組織經(jīng)過(guò)勻漿、澄清、去除雜蛋白、濃縮及滅活制備而成，療效較為確切，但是由于腦組織殘留和純化問(wèn)題，其大規(guī)模生產(chǎn)不易且成本過(guò)高。地鼠腎細(xì)胞滅活和減毒活疫苗疫苗制備過(guò)程中亦存在鼠源的性蛋白及生產(chǎn)中易出現(xiàn)污染等原因。而Vero細(xì)胞乙腦滅活疫苗雖說(shuō)較易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)但存在DNA的殘留問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種人二倍體細(xì)胞乙型腦炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案：

一種人二倍體細(xì)胞乙型腦炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟：

步驟一：人二倍體細(xì)胞株的復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)：人二倍體細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇、轉(zhuǎn)瓶傳代培養(yǎng)2～3代后，消化細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液；

步驟二：人二倍體細(xì)胞株的多級(jí)生物反應(yīng)器培養(yǎng)；將經(jīng)復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)和消化后制成的人二倍體細(xì)胞懸液進(jìn)行二級(jí)以上的生物反應(yīng)器線性放大技術(shù)培養(yǎng)；

步驟三：接種乙型腦炎病毒毒株，進(jìn)行病毒增殖培養(yǎng)：生物反應(yīng)器線性放大技術(shù)培養(yǎng)的最終生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到10⁶個(gè)/ml以上后，將細(xì)胞生長(zhǎng)液更換為病毒維持液，并將乙型腦炎病毒毒株接種至其中，進(jìn)行病毒增殖培養(yǎng)；

步驟四：收獲病毒培養(yǎng)液：更換病毒維持液24小時(shí)后，收獲病毒培養(yǎng)液，同時(shí)每天抽樣檢測(cè)病毒培養(yǎng)液的滴度，每批次的培養(yǎng)液收獲15～25天；

步驟五：收獲的病毒培養(yǎng)液經(jīng)滅活、超濾、純化和添加保護(hù)劑后，配制疫苗。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述的人二倍體細(xì)胞株為WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一種，所述的乙型腦炎病毒毒株為P3株或SA14-14-2株。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述的生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器或搖擺式氣液交替培養(yǎng)生物反應(yīng)器。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述病毒維持液為BME病毒維持液，所述保護(hù)劑為糖蛋白保護(hù)劑。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟二的每一級(jí)的生物反應(yīng)器中的人二倍體細(xì)胞株達(dá)到10⁶個(gè)/ml以上的細(xì)胞密度后，消化，洗脫，離心沉淀，收集及重懸細(xì)胞，并按照放大比例通過(guò)密閉的管路系統(tǒng)接種至下一級(jí)生物反應(yīng)器培養(yǎng)。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟二的每一級(jí)生物反應(yīng)器中加入供細(xì)胞貼附的微載體和細(xì)胞懸液，所述一級(jí)生物反應(yīng)器中加入的細(xì)胞懸液濃度為10⁶個(gè)/ml以上，所述一級(jí)生物反應(yīng)器培養(yǎng)的工作體積約10L，所述的放大比例為前一級(jí)生物反應(yīng)器工作體積的10～20倍。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述的每一級(jí)生物反應(yīng)器中加入的微載體為顆粒狀實(shí)心微球載體、多孔性微球載體、網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)載體和片狀纖維結(jié)構(gòu)載體中的任一種。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟四收獲病毒培養(yǎng)液的方式為間隔式收獲培養(yǎng)液或連續(xù)灌注式收獲培養(yǎng)液。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述的間隔式收獲培養(yǎng)液具體為：間隔24～48小時(shí)收獲培養(yǎng)體積80％～90％的病毒培養(yǎng)液后，繼續(xù)補(bǔ)加BME維持液至原培養(yǎng)體積。

進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述的連續(xù)灌注式收獲培養(yǎng)液具體為：每天連續(xù)流出病毒培養(yǎng)液，并每天收獲工作體積80％～90％的病毒培養(yǎng)液，同時(shí)連續(xù)等量補(bǔ)加BME維持液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明采用人二倍體細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)，安全且無(wú)外源因子污染。

(2)本發(fā)明采用逐級(jí)線性放大的生物反應(yīng)器培養(yǎng)，易于實(shí)現(xiàn)較低成本，較高質(zhì)量安全性和穩(wěn)定性的疫苗大規(guī)模化生產(chǎn)。

(3)本發(fā)明每天抽樣檢測(cè)病毒收獲液的滴度保證了所收獲的病毒培養(yǎng)物的高表達(dá)，保證了生產(chǎn)質(zhì)量。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種人二倍體細(xì)胞乙型腦炎滅活疫苗的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟：