[發明專利]一種順序富集多磷酸化肽和單磷酸化肽的方法

無效

• 申請號: 201110358286.7
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN103102388A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 李秀玲;郭志謀;梁鑫淼
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/20
• 分類號: C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及磷酸化肽的富集，具體地說是一種采用反相/強陽離子交換混合模式材料順序富集多磷酸化肽和單磷酸化肽的方法。

背景技術

可逆的蛋白質磷酸化在細胞生命活動中發揮著重要的調控作用，因此研究生物樣品中的磷酸化蛋白對于揭示生命過程的調節機制是非常有意義的。生物質譜是解析磷酸化肽段結構的強有力工具，但是質譜在鑒定磷酸化蛋白方面仍然面臨著巨大的挑戰，主要是由于磷酸化肽的豐度低和質譜中大量非磷酸化肽段的信號抑制作用。因此，在質譜分析檢測前對磷酸化肽進行選擇性富集是十分必要的。目前，固定化金屬親和色譜(IMAC)和二氧化鈦(TiO₂)是最常用的磷酸化肽的分離富集材料。其中IMAC是目前使用最廣泛最傳統的富集方法，但是與磷酸化肽共流出的酸性非磷酸化肽降低了此方法的選擇性。TiO₂方法因其此較高的磷酸化肽選擇性在磷酸化蛋白組學中應用越來越多，但是多磷酸肽難于從TiO₂材料上洗脫下來。

近年來混合模式材料受到科研工作者的廣泛關注，如反相/弱陰離子交換材料、親水/陽離子交換材料和反相/強陽離子交換混合模式材料。這些材料中反相/強陽離子交換混合模式材料被填裝在色譜柱中用于分離富集磷酸化肽。但是該方法富集磷酸化肽存在兩點不足：不能有效分離多磷酸化肽和單磷酸化肽；柱色譜操作費時。

將反相/強陽離子交換材料與柱固相萃取模式或分散固相萃取模式有機的結合，可實現復雜混合物中磷酸化肽快速、簡單、可重復、高通量地富集。因此，利用此材料的不同色譜作用機理，結合柱固相萃取模式或分散固相萃取模式的快速和簡單等特性，實現多磷酸化肽和單磷酸化肽的選擇性富集，可推動磷酸化蛋白組學的進步。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有高選擇性、高通量、簡單、重復性好的磷酸化肽的分離富集方法，能對痕量多磷酸化肽和單磷酸化肽進行順序選擇性富集。

采用反相/強陽離子交換混合模式材料與磷酸化蛋白酶解物接觸，然后順序富集多磷酸化肽和單磷酸化肽；

所述反相/強陽離子交換混合模式材料是由兩種或兩種以上硅烷試劑在硅膠表面經過共聚反應形成，其結構式如下：

其中，Silica?Gel為硅膠，NP為碳原子數為4～18的正鏈烷基，P為極性基團，包括以碳原子數為1～8的正鏈烷基相連接的氯原子、溴原子、氰基、苯磺酸基或磺酸基、羧基。

富集材料為反相/強陽離子交換混合模式材料，材料的粒徑是2-0μm，孔徑為50-

具體操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式；

采用柱固相萃取(SPE)模式用反相/強陽離子交換混合模式材料順序富集磷酸肽時，將磷酸化蛋白酶解物上到SPE柱上，采用洗脫溶劑臺階梯度，分別先后富集出多磷酸化肽和單磷酸化肽；

或采用分散固相萃取模式用反相/強陽離子交換混合模式材料順序富集磷酸肽時，將磷酸化蛋白酶解物上直接與富集材料混合，采用洗脫溶劑，使用離心方式、臺階梯度洗脫條件，分別先后富集出多磷酸化肽和單磷酸化肽。

上樣量為富集材料與蛋白酶解物質量比例為10-200∶1，富集溫度為15-60℃。

本發明具有如下優點：

1.本發明制備的反相/強陽離子交換混合模式材料在分離富集磷酸化肽時表現出了高選擇性和高通量等特點，可以實現多磷酸化肽和單磷酸化肽的有效分離和富集；

2.本發明制備的反相/強陽離子交換混合模式材料既可以方便的裝填成不同長度，不同內徑的柱子，又可以直接添加與離心管，操作簡單，易于重復。特別適合微量生物樣品中磷酸化肽段的分離富集；

3.本發明富集得到的磷酸化肽可直接用于電噴霧-質譜分析(ESI-MS)或者基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALD-TOF?MS)，提高了質譜的檢測限和靈敏度。

附圖說明

圖1為萃取模式模式下對標準磷酸化蛋白α-casein(80pmol)酶解產物中磷酸化肽經過不同方法富集后的ESI-MS譜圖。(a)α-casein酶解產物經TiO₂富集后的磷酸化肽餾分；(b)α-casein酶解產物經反相/強陽離子交換混合模式材料富集后的單磷酸化肽餾分；(c)α-casein酶解產物經反相/強陽離子交換混合模式材料富集后的多磷酸化肽餾分；(d)α-casein酶解產物直接去鹽后的質譜圖。