[發明專利]一種順序富集多磷酸化肽和單磷酸化肽的方法

無效

• 申請號: 201110358286.7
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN103102388A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 李秀玲;郭志謀;梁鑫淼
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/20
• 分類號: C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種順序富集多磷酸化肽和單磷酸化肽的方法，其特征在于：

采用反相/強陽離子交換混合模式材料與磷酸化蛋白酶解物接觸，然后順序富集多磷酸化肽和單磷酸化肽；

所述反相/強陽離子交換混合模式材料是由兩種或兩種以上硅烷試劑在硅膠表面經過共聚反應形成，其結構式如下：

其中，Silica?Gel為硅膠；NP為碳原子數為4～18的正鏈烷基；P為含有負離子的極性基團，包括以碳原子數為1～8的正鏈烷基相連接的氯原子、溴原子、氰基、苯磺酸基、磺酸基或羧基。

2.按照權利要求1所述方法，其特征在于：富集材料為反相/強陽離子交換混合模式材料，材料的粒徑是2-50μm，孔徑為50-

所述兩種或兩種以上硅烷試劑為非極性硅烷試劑和/或極性硅烷試劑。

3.按照權利要求1所述方法，其特征在于：

具體操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式；

在柱固相萃取(SPE)模式下采用反相/強陽離子交換混合模式材料順序富集磷酸肽時，將磷酸化蛋白酶解物上到以反相/強陽離子交換混合模式材料為填料的SPE柱上，采用洗脫溶劑梯度，分別先后富集出多磷酸化肽和單磷酸化肽；

或在分散固相萃取模式下采用反相/強陽離子交換混合模式材料順序富集磷酸肽時，將磷酸化蛋白酶解物上直接與富集材料混合，采用洗脫溶劑，使用離心方式、臺階梯度洗脫條件，分別先后富集出多磷酸化肽和單磷酸化肽。

4.按照權利要求3所述方法，其特征在于：樣品的上樣量為反相/強陽離子交換混合模式材料與磷酸化蛋白酶解物質量比例為10-200∶1，富集溫度為15-60℃；磷酸化蛋白為α-酪蛋白、β-酪蛋白或卵清蛋白。

5.按照權利要求3所述磷酸化肽分離富集方法，其特征在于：

富集多磷酸化肽時采用的洗脫溶劑是體積濃度為10-50％的乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?2-6；洗脫溶液的用量為3-40倍柱體積的多磷酸化肽洗脫溶液。

6.按照權利要求3所述磷酸化肽分離富集方法，其特征在于：

洗脫單磷酸化肽時采用的洗脫溶劑為下述溶劑之一，

1)含有2-50mM甲酸銨的體積濃度為10-50％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?2.2-4.3；

2)含有2-50mM乙酸銨的體積濃度為10-50％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?4.3-5.0；

3)含有2-50mM磷酸二氫鉀的體積濃度為10-50％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?2.2-4.3；

洗脫溶液的用量為3-40倍柱體積的單磷酸化肽洗脫溶液。

7.按照權利要求3所述磷酸化肽分離富集方法，其特征在于：

采用分散固相萃取模式，

1)磷酸化蛋白酶解物直接與富集材料孵化時間0.5分鐘-12小時，離心，收集上清液；

2)離心后富集材料與洗脫液孵化時間0.5分鐘-12小時，離心，收集上清液；

3)重復步驟2)的孵化、離心和收集過程1-10次。

8.按照權利要求1或3所述磷酸化肽分離富集方法，其特征在于：

當采用反相/強陽離子交換混合模式材料富集出單磷酸化肽后，采用含有20-200mM甲酸銨、乙酸銨或磷酸二氫鉀的體積濃度60-90％乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH?2-6，將富集材料上的非磷酸化肽洗脫出來。