[發(fā)明專利]采用金屬氧化物富集糖肽的通用方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110358235.4
• 申請(qǐng)日: 2011-11-11
• 公開（公告）號(hào): CN103105327A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李秀玲;閆竟宇;梁鑫淼
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): G01N1/40
• 分類號(hào): G01N1/40;G01N1/34
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化分析領(lǐng)域，具體地說是一種金屬氧化物在富集糖肽中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)糖基化是一種存在最為普遍的翻譯后修飾過程。約50％以上的蛋白質(zhì)存在糖基化現(xiàn)象。蛋白質(zhì)糖基化涉及到細(xì)胞免疫、受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多生物過程。已有研究表明糖蛋白的異常與某些疾病有著密切關(guān)系。另外，一些糖蛋白由于其特殊的生物功能已經(jīng)被開發(fā)成藥物。因此對(duì)糖蛋白進(jìn)行深入的研究可以更好的認(rèn)識(shí)和解釋生命現(xiàn)象，揭示疾病的發(fā)生過程，并且對(duì)于疾病早期診斷和新靶點(diǎn)藥物開發(fā)具有重要作用。但由于糖蛋白樣品經(jīng)酶解后酶解液中糖肽豐度非常低，并且糖肽在質(zhì)譜中受非糖肽的離子抑制，導(dǎo)致糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析非常具有挑戰(zhàn)性。因此，在質(zhì)譜分析前對(duì)糖肽進(jìn)行富集是非常必要的。

近年來，糖肽的富集方法主要有凝集素親和色譜法、肼化學(xué)法、硼酸親和色譜法及親水作用色譜法。凝集素親和色譜法是應(yīng)用最廣、選擇性好，但存在糖基化覆蓋率低的問題[Kubota，K.；Sato，Y.；Suzuki，Y.et?al.Anal.Chem.2008，80，3693]；肼化學(xué)對(duì)糖肽的高選擇性使其在高通量的N-型糖蛋白位點(diǎn)鑒定中獲得了很好的應(yīng)用，但是該方法存在糖基化覆蓋率低和丟失糖鏈的信息等問題[Zhang，H.；Li，X.J.；Martin，D.B.；Aebersold，R.Nat.Biotechnol.2003，21，660.]；硼酸親和色譜法能與順勢(shì)二醇形成硼酸酯結(jié)構(gòu)也可以用來富集糖肽，但這種方法的費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)[Zhou，W.；Yao，N.；Yao，G.P.；Deng，C.H.；Zhang，X.M.；Yang，P.Y.Chem.Commun.2008，5577.]。親水作用色譜可富集不同類型的糖肽，糖基化覆蓋率高，但是容易受到具有相當(dāng)極性的非糖肽的干擾[Wada，Y.；Tajiri，M.；Yoshida，S.Anal.Chem.2004，76，6560.]。因此需要開發(fā)對(duì)糖肽選擇性高、糖基化覆蓋率廣的富集方法。

近年，氧化鈦在親水作用色譜模式下被用來富集含有唾液酸的糖肽和中性糖肽[Yan，J.，Li，X.，Yu，L.，Jin，Y.，et?al.，Chem.Commun.2010，46，5488]。該方法可以實(shí)現(xiàn)糖肽的高選擇性富集，但是不同的糖肽需要不同的沖洗和洗脫條件，導(dǎo)致方法的通用性不夠，不適合未知的、復(fù)雜樣品。另外，氧化鈦在親水作用色譜模式下富集糖肽，所采用的上樣條件是中性、沖洗條件和洗脫條件都酸性。因此針對(duì)氧化鈦材料需要開發(fā)通用性的糖肽富集方法，采用酸性的上樣條件和堿性的淋洗條件和洗脫條件，以便于實(shí)際復(fù)雜生物樣品的分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有具有選擇性高、糖基化覆蓋率廣、通用性廣、操作簡(jiǎn)單和重復(fù)性好的糖肽富集方法，能對(duì)痕量糖肽進(jìn)行選擇性富集。

具體操作時(shí)采用萃取模式模式，過程如下：

1)將氧化鈦裝入萃取柱中，采用沖洗液平衡柱子，將糖蛋白酶解物(pH2-6)上到柱上，金屬氧化物材料與糖蛋白酶解物重量比例為10-200∶1；

2)采用2-50倍金屬氧化物材料柱體積的pH?7-10的0-50％淋洗溶液沖洗，去處非糖肽；重復(fù)此步驟1-10次；

3)采用2-50倍金屬氧化物材料柱體積的pH?10.1-14的0-50％洗脫溶液洗脫糖肽。重復(fù)此步驟1-10次。

具體操作時(shí)采用離心模式，過程如下；

1)將糖蛋白酶解物(pH?2-6)直接與金屬氧化物(材料與糖蛋白酶解物質(zhì)量比例為10-200∶1)混合，孵化0.5分鐘-1小時(shí)，離心，棄上層溶液，收集沉淀；

2)離心后的金屬氧化物與2～50倍材料柱體積的pH為7-10的0-50％淋洗溶液混合，孵化0.5分鐘-1小時(shí)，離心，棄上層溶液，收集沉淀；重復(fù)此步驟1-10次；

3)離心后的金屬氧化物與2～50倍材料柱體積的pH為10.1-14的0-50％洗脫溶液混合，孵化0.5分鐘-1小時(shí)，離心，收集上清液，得到糖肽。重復(fù)此步驟1-10次。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于金屬氧化物富集糖肽時(shí)表現(xiàn)出了高選擇性、高糖基化覆蓋率、通用性廣等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)糖肽的有效富集；

2.本發(fā)明涉及的金屬氧化物既可以方便的裝填成不同長(zhǎng)度，不同內(nèi)徑的柱子，又可以直接添加與離心管，操作簡(jiǎn)單，易于重復(fù)。特別適合微量生物樣品中糖肽段的富集；

3.本發(fā)明富集得到的糖肽可直接用于電噴霧-質(zhì)譜分析(ESI-MS)或者基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD-TOF?MS)，提高了質(zhì)譜的檢測(cè)限和靈敏度。