[發明專利]抑制HIV-1的雙長發卡結構RNA表達原件的構建及功能檢測

無效

• 申請號: 201110357481.8
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN102352360A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 劉暢;孔曉紅;梁之聘;袁青;刁丹紅
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/85;C12Q1/68
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬基因工程技術領域。

背景技術

艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired?Immunodeficiency?Syndrome，AIDS)，由人類免疫缺陷病毒(Human?Immunodeficiency?Virus，HIV)感染引起，是最嚴重的流行病之一。而抑制HIV-1的復制可以有效改善艾滋病病人的生命狀況，同時也是HIV-1相關研究的必要實驗手段。目前，抑制HIV-1的方法包括：通過逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、受體類似物以及RNA干擾等方法。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是通過在基因轉錄水平抑制HIV-1的基因表達的方法。實現RNAi的方法包括：化學合成小的siRNA片段直接進行RNAi，或通過基因載體表達人工RNAi誘導前體進行RNAi。化學合成siRNA由于成本較高，難于廣泛使用。通過基因載體表達人工RNAi誘導前體進行RNAi，通常是通過DNA依賴的RNA聚合酶III(Pol?III，U6或H1啟動子)轉錄表達的短RNA折疊而成的發卡結構，稱為短發卡RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)。目前已報道針對HIV-1的近兩百條已通過實驗檢測效果的siRNA或shRNA序列，為HIV-1的RNAi靶位點的選取提供大量信息和參考依據。但同時由于HIV-1復制迅速、突變率高的特點，使單一的RNAi沒有有效的抑制效果。數學模型以及相關的實驗數據顯示，至少需要4個不同的靶位點的siRNA才可以有效抑制HIV-1產生逃逸突變。對HIV-1的RNAi基因治療應采用多靶位RNAi的方式。如果采用多個單獨的shRNA表達原件進行多個獨立抑制，往往會對正常的細胞RNA干擾通路進行干擾，因此可以采用多個RNAi通過單一啟動子進行實現。本發明采用單一啟動子表達RNA，形成特殊的雙長發卡結構，對HIV-1的多個基因進行RNAi抑制。

發明內容

本發明的目的是為了實現對多個HIV-1的基因進行抑制，設計針對HIV-1不同靶基因區域的siRNA序列，通過Two-Step?PCR的方法構建針對HIV-1的dlhRNA-VGTE的表達原件，并構建于載體質粒。建立體外實驗研究其抑制HIV基因融合EGFP表達質粒系統的效果，在體外實驗細胞水平中通過顯微熒光及流式細胞分析檢測其抑制HIV-1基因表達的效果。實現單一表達原件對多個HIV-1基因的表達抑制。

本發明首先提供了抑制HIV-1的雙長發卡結構RNA表達原件(dlhRNA-VGTE)的基因序列，該序列是序列表SEQ?ID?No.1所示的序列，序列標注見附圖4；該表達原件在真核細胞中，通過聚合酶的作用，轉錄成RNA，折疊成為dlhRNA的二級結構，在核酸酶Dicer的作用下，被切割成為四個獨立的siRNA(19nt)分別行使RNA干擾作用。

本發明根據HIV-1序列保守性和RNAi靶序列特點，分別選擇了HIV的4個基因：2個結構基因env，gag和2個調節基因vpu，tat作為抑制靶點，設計選取權利要求1所述序列靶向HIV-1的如下四個RNAi靶序列：

上述序列用Blast在線進行同源分析證實為HIV-1保守序列。

其次，本發明提供了所述雙長發卡結構RNA表達原件(dlhRNA-VGTE)序列的構建方法，該方法通過Two-step?PCR法獲得(long?hairpin?RNA，lhRNA)長發卡RNA表達原件，再以lhRNA為模板經過Two-step?PCR法獲得(double?long?hairpin?RNA，dlhRNA)雙長發卡RNA表達原件；具體方法如下：

1)含有lhRNA表達原件的表達質粒pGMT-lhRNA-VG的構建：

第一輪PCR

上游序列：5’-AAGATCTGGGCAGGAAGAGGG-3’

下游序列：5’-CTGGGTCAGGGACATAAATCTTGTGGGGTGGCTCCCTATTGCCACTGTCTTCTGCTCCGACTCTCGTCCTTTCCACAAG-3’

PCR反應體系及條件：

第二輪PCR

上游序列：AAGATCTGGGCAGGAAGAGGG-3’

下游序列：5’-AAAAAAGGAGCAGAAGACAGTGGCAATGGGGAGCC

??????????ACCCCACAAGATTTACGTCTGGGTCAGGGACATAAATC-3’

PCR反應體系及條件：