[發明專利]一種微RNA功能的雙熒光報告系統的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110357357.1
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN102443595A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 崔宗強;尤祥宇;張先恩;張治平
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及微RNA功能檢測的技術領域，更具體涉及一種檢測微RNA功能的雙熒光報告系統的制備方法，同時還涉及一種微RNA功能的雙熒光報告系統的用途。在同一載體中利用不同的真核啟動子，既可轉錄微RNA，又能轉錄紅色熒光蛋白mCherry基因，并且在mCherry基因的3’-UTR區可連入微RNA作用的靶標序列以控制mCherry的表達；同時，該載體還能獨立表達綠色熒光蛋白EGFP作為內參照。實驗中，通過測量綠色熒光蛋白EGFP和紅色熒光蛋白mCherry的熒光強度比值，與對照組相比較就可以評價微RNA的抑制功能。該新系統為一種簡單、有效、方便、可靠的微RNA功能檢測的質粒報告系統。

背景技術

微RNA?(miRNA)是一類大小18-24nt的內源表達的非編碼RNA，它廣泛分布于大多數的真核生物中。至今，通過遺傳學、分子克隆、生物信息學預測等方法已在上百種生物中鑒定出萬余種miRNA，它們遍布存在于動物、植物、真菌等多細胞真核生物甚至病毒中。并且，miRNA在各個物種間具有高度的進化保守性，其中在莖部的保守性更強，在環部則容許更多的突變位點存在。截至目前，在人類細胞中發現的miRNA就多達721種，在各類病毒中也發現有200多種。miRNA作用于mRNA轉錄后階段以調控基因的表達，進而參與細胞內一系列生物學過程或參與病毒復制過程等。

目前，miRNA的研究主要包括miRNA基因的尋找、鑒定及其對應的靶基因的尋找、驗證等。其基本思路是首先利用計算學方法預測miRNA基因及其靶基因，然后通過直接或間接方法來測定驗證其功能。目前，絕大部分預測miRNA基因的計算學方法多是基于miRNA前體特殊的生物學特征，如其在所有物種中都具有的保守的發夾結構及比其他RNA更穩定的構象等。

在預測miRNA的基礎上，對于miRNA鑒定及其表達分析則是另一個研究重點。一般地，miRNA的鑒定及miRNA表達分析大多還是使用如RT-PCR、分子克隆、測序、Northern?blot、microarray等傳統方法。利用microarray對miRNA作表達譜分析在一定程度上可做到全局，高通量并具一定的重復性，但這種基于核酸雜交信號檢測的方法有著固有的缺陷，如最多只能做到半定量檢測，不適合用來鑒定新miRNA等。為了克服這些缺陷，“下一代測序技術”，即基于邊合成邊的測序方法(sequencing-by-synthesis，SBS)，也被用于miRNA鑒定及表達分析。如利用SBS技術對急性骨髓性白血病(acute?myeloid?leukemia)相關的miRNA作miRNA表達譜分析，不但鑒定了大量已知的miRNA還鑒定了55種新的miRNA。

預測并鑒定了miRNA，接下來就是對其靶基因的尋找及驗證，以研究其真正的生物學功能。自發現miRNA以來，功能驗證及靶基因驗證一直都是闡述miRNA重要性及生物學意義的重要研究內容。然而，對于miRNA的功能驗證及靶基因驗證，難度很大，目前方法也不是很多。如上所述，以人類為例，據推測人類基因組編碼大概1000種miRNA，而一個特定的miRNA能以不同結合效率靶向幾十甚至上百條mRNA；反過來，一條mRNA也可能被多條miRNA靶向。這樣就建立了一套極其復雜的miRNA調控基因表達的網狀系統。比起miRNA靶基因的預測過程，miRNA靶基因的驗證仍是一個極為費時費力的過程。目前，對于驗證miRNA靶基因仍沒有便捷的方法。迄今最為常用的還是基于報告基因實驗對miRNA進行功能驗證和靶基因驗證。基于報告基因實驗的方法是一種間接檢測手段。在此基礎上結合傳統的實驗方法，如缺失突變特定miRNA基因、沉默特定miRNA基因的表達、過量表達特定miRNA等方法，后通過qRT-PCR、microarray等手段觀察假定靶mRNA的表達變化情況，既可綜合判斷miRNA對靶基因的抑制作用。

常用的報告基因有熒光素酶，有時也用熒光蛋白(如EGFP)等。目前所用的報告基因系統一般包括兩個載體：一個載體用來轉錄miRNA，另一個載體則一般是在報告基因的3’-UTR區連入多個重復的根據miRNA序列設計的非完全互補序列(功能驗證)或連入假設的靶基因3’-UTR序列(靶基因驗證)。實驗時，將兩個載體共轉染于細胞中，轉染一定時間后根據與對照組的比較結果評判報告基因表達的抑制情況。目前的報告基因系統用于miRNA功能檢測存在許多缺陷。譬如，兩個質粒同步轉染難以保證目的mRNA及其靶標等基因的等量或同比例表達，實驗重復性不好。更為重要的是，現有的報告系統如熒光素酶系統檢測信號時需要破碎或固定細胞，無法在活細胞內檢測miRNA的功能等。