[發明專利]一種微RNA功能的雙熒光報告系統的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110357357.1
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN102443595A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 崔宗強;尤祥宇;張先恩;張治平
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種微RNA功能的雙熒光報告系統的制備方法，其步驟是：

A、自質粒pRSET-B-mCherry上通過PCR擴增獲得mCherry基因序列，利用雙酶切位點Nhe?I和Bgl?II，把mCherry基因插入pEGFP-C1載體上，替代pEGFP-C1上的EGFP序列，構建成載體pmCherry-C1；

B、以RNAi-Ready?pSIREN-RetroQ質粒為模板，PCR擴增獲得U6啟動子片段，PCR使用的上游引物：5’-CAACATACGCGTTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCC-3’(Mlu?I)，下游引物：5’-ATGGATACGCGTGCGGCCGCGACTGATATCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGAT-3’，PCR擴增條件為：94℃5min，一個循環；94℃45s，60℃50s，72℃30s，進行30個循環；最后72℃延伸5min，擴增的產物經1％∶1克瓊脂糖/100毫升水瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下目的條帶，后用膠回收試劑盒進行回收，取2微克的回收產物及載體pmCherry-C1用Mlu?I酶切3小時，用PCR產物純化試劑盒回收，將Mlu?I消化后的pmCherry-C1片段進行去磷酸化處理，37℃1h反應，65℃10min滅活磷酸化酶處理后，將反應產物用PCR產物純化試劑盒回收，將回收后的酶切PCR產物和經酶切、去磷酸化處理的pmCherry-C1片段以至少摩爾比3∶1比例混合，用T4DNA連接酶16℃過夜連接后轉化E.coli?GS500，挑取克隆，提質粒，酶切測序驗證，獲得phU6-mCherry-C1；

C、將pAdtrack-CMV質粒用Pac?I酶切，膠回收試劑盒回收大片段后，再將回收產物用EcoR?V酶切，膠回收試劑盒回收小片段，以上述回收產物為模板擴增帶有CMV?promoter、EGFP?ORF及poly?A尾的EGFP表達框序列：pAdtrack-CMV??上358-1944位置，使用上游引物：5’-TACACAATCCACTACGTGCGCGTTAAGATACATTGATGAG-3’，下游引物：5’-TACACAAACCACGTAGTGTAATAGTAATCAATTACGGGGTC-3’，PCR擴增條件為94℃5min，一個循環；94℃45s，60℃50s，72℃2min，進行30個循環；最后72℃延伸10min，擴增的產物經1％∶1克瓊脂糖/100毫升水瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下目的條帶，后用膠回收試劑盒進行回收，取2微克的回收產物及載體phU6-mCherry-C1用Dra?III酶切3小時后用PCR產物純化試劑盒回收，將Dra?III消化后的phU6-mCherry-C1片段進行去磷酸化處理，將反應產物用PCR產物純化試劑盒回收，將回收后的酶切PCR產物和經酶切、去磷酸化處理的phU6-mCherry-C1片段以至少摩爾比3∶1比例混合，用T4DNA連接酶16℃過夜連接后轉化E.coliGS500，挑取克隆，提質粒，酶切測序驗證，獲得質粒pMGhU6。

2.權利要求1所述的微RNA功能的雙熒光報告質粒pMGhU6在微RNA的抑制功能檢測中的應用。