[發明專利]四環素半抗原及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110356497.7
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN103102300A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 何方洋;馮才偉;孫震;吳鵬;趙正苗;陳煒玲;劉琳
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: C07D211/62
• 分類號: C07D211/62;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K14/75;C07K14/435;C07K1/113;C07K16/44;G01N33/577;G01N21/31;G01N33/535
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技術領域

本發明涉及一種半抗原及其制備方法和應用，具體涉及四環素半抗原及其制備方法和應用。

背景技術

四環素類藥物(TCs)具有廣譜高效的殺菌抗生功效，可以與大多數藥物或飼料添加劑混用，已被廣泛應用于畜禽生產中。但過量使用不可避免的造成了嚴重的藥物殘留，成為嚴重危害人類健康的食品安全隱患之一。為此世界各國對TCs殘留的檢測十分關注。歐盟第675/92號令中初步規定在肌肉及牛奶中的四環素族化合物的總量不得超過100μg/kg，在腎臟、肝臟及雞蛋中分別不得超過600μg/kg、300μg/kg及200μg/kg。日本肯定列表制度規定奶和雞蛋中四環素類化合物的總量分別不得超過100ng/mL和400ng/mg。

已報道的四環素類藥物殘留的檢測方法有微生物法、薄層色譜法、高效液相測定法、高效液相色譜-串聯質譜法、毛細管電泳、電化學分析、化學發光、酶聯免疫法等，儀器檢測方法對待測樣品的前處理要求高，操作繁瑣，需要精密儀器設備。免疫學方法具有快速、靈敏、特異性高等特點，是藥品殘留檢測的有效方法之一。目前常采用酶聯免疫檢測試劑盒對大量樣品進行四環素類藥物殘留的初篩，篩選陽性樣品再用儀器方法進行進一步確證。

發明內容

本發明的目的是提供一種四環素半抗原及其制備方法。

本發明提供的四環素半抗原分子結構式為：

本發明提供的四環素半抗原的制備方法，包括如下步驟：

取1.1-2.2g四環素，四環素用量優選為1.1g，0.37-0.75g?4-哌啶甲酸，4-哌啶甲酸用量優選為0.37g，2-5ml?37％甲醛，甲醛用量優選為2ml，在50-100ml乙醇中混合，乙醇用量優選為50ml，在60％微波強度下反應3-5分鐘；除去溶劑后，反相柱層析分離，得到黃色固體。

本發明的另一個目的是上述四環素半抗原在免疫檢測中的應用，具體包括由所述四環素半抗原與載體蛋白偶聯得到的四環素類藥物抗原，及由所得四環素類藥物抗原免疫動物制備得到的四環素類藥物抗體。

其中所述載體蛋白可為牛血清蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清白蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

所述抗體為四環素類藥物單克隆抗體。

本發明還提供由上述四環素類藥物抗體制備的酶聯免疫試劑盒，及其在檢測動物源性食品中四環素類藥物殘留的應用。

本發明提供的四環素半抗原是利用曼尼希反應，在其酰胺的胺基上引入了N-甲基-4-哌啶甲酸基團的衍生物，合成方法簡單，純度、產率較高；用該半抗原作為原料，制備適于動物免疫的抗原體系免疫動物，所得抗體的效價、親和力都比較好；所得的抗體用于酶聯免疫試劑盒，該酶聯免疫試劑盒可以檢測四環素、金霉素、土霉素、強力霉素、米諾環素、去甲金霉素、吡甲四環素。試劑盒使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準確、快速、可同時檢測大批量的樣本，適于動物源性食品中四環素類藥物殘留的現場監控和大量樣本的篩查。本發明的四環素半抗原在四環素類藥物的檢測中發揮重要作用。

附圖說明

圖1：四環素半抗原合成圖

圖2：四環素半抗原核磁共振氫譜圖

圖3：四環素類藥物ELISA標準曲線

具體實施方式

下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用來限制本發明的范圍。

實施例1：四環素半抗原的合成和鑒定

取1.1g四環素，0.37g?4-哌啶甲酸，2ml?37％甲醛，在50ml乙醇中混合，在60％微波強度下反應3-5分鐘；除去溶劑后，反相柱層析分離，得到黃色固體。

取上述產物經核磁共振氫譜測定，如圖2所示，圖譜中10.5ppm(mg/L)附近的峰為羧酸上的H，2～3ppm(mg/L)之間的峰為哌啶環上的H，初步說明半抗原合成成功。

實施例2：四環素類藥物抗原

將四環素半抗原與載體蛋白偶聯得到四環素類藥物抗原。

一、免疫原制備——四環素半抗原-牛血清白蛋白(BSA)偶聯物合成