[發(fā)明專利]人參和西洋參快速鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110355478.2
• 申請(qǐng)日: 2011-11-10
• 公開（公告）號(hào): CN102505045A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓建萍;陳曉辰;姚輝;宋經(jīng)元;陳士林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明術(shù)語中藥材來源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用特異的SNP鑒定人參和西洋參的方法。

背景技術(shù)

人參(Panax?ginseng)和西洋參(Panax?quinquefolius)分別為五加科人參屬植物和干燥根，皆系名貴中藥材，因補(bǔ)虛治病效果顯著，臨床應(yīng)用日趨廣泛。二者的性狀非常相似，顏色基本一致，用傳統(tǒng)方法很難將其區(qū)別。但兩者在藥性和功效上有很大差別，人參具補(bǔ)氣、固脫、生津、益智、安神的功效。西洋參具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，益胃生津，清熱除煩之功效。這就需要尋找到一種穩(wěn)定可靠的方法將人參和西洋參藥材、飲片和粉未加以鑒定區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明第一個(gè)目的在于提供人參和西洋參鑒定用SNP。

本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供人參和西洋參鑒定用SNP在人參和西洋參鑒定用的應(yīng)用。

本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供人參和西洋參鑒定方法

本發(fā)明提供的人參和西洋參鑒定用SNP，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其中，自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第32位為C或T和/或第43位為T或C。

本發(fā)明提供的SNP可用于鑒定人參和西洋參，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第32位為C和/或第43位為T，則鑒定為人參，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第32位為T和/或第43位為C，則鑒定為西洋參。

本發(fā)明提供的人參和西洋參鑒定方法，其包括如下步驟：

1)以待測(cè)樣品DNA為模板，擴(kuò)增含有SEQ?ID?No.1所示序列的片段；

2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，拼接后去除序列兩端5.8S和26S基因區(qū)，獲得完整ITS2基因間隔區(qū)，通過分析SEQ?ID?No.1所示的序列，確定自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第32位和/或第43位的堿基。

其中，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第32位為C和/或第43位為T，則鑒定為人參，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第32位為T和/或第43位為C，則鑒定為西洋參。

本發(fā)明發(fā)明人通過大量的引物設(shè)計(jì)和篩選，意外地發(fā)現(xiàn)一對(duì)特異性好，擴(kuò)增效率高的引物，其序列為：

ITS2-F：AACCATCGAGTCTTTGAACGC；

ITS2-R：CCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCC。

上述引物用于擴(kuò)增人參或西洋參的ITS2序列。

本發(fā)明還提供含有上述引物的人參和西洋參鑒定試劑盒。

本發(fā)明方法適用性更廣，能檢測(cè)所有能提取出DNA的人參和西洋參任何樣品。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)人參、西洋參原植物、藥材、生飲片和粉未的快速、準(zhǔn)確鑒定。

附圖說明

圖1所示為ITS2序列的擴(kuò)增結(jié)果。

圖2所示為人參和西洋參ITS2序列的比對(duì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

1)從不同產(chǎn)地收集的39份人參和17份西洋參樣品，分別取20mg藥材，在MM400球磨儀(德國(guó)Retsch)上進(jìn)行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒提取總DNA。

表1人參和西洋參樣品

2)PCR擴(kuò)增

引物序列為ITS2-F：AACCATCGAGTCTTTGAACGC；ITS2-R：CCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCC，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2μmol/μL。

25μL反應(yīng)體系：PCR?Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA?1μL(～30ng)，Taq?DNA聚合酶1.0U，加滅菌雙蒸水至25μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)程序：在PCR儀上按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：

分別取5μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后在凝膠成像儀上檢測(cè)結(jié)果。(圖1)。

3)測(cè)序