[發(fā)明專利]一種紅外光譜測定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110353783.8
• 申請(qǐng)日: 2011-11-10
• 公開（公告）號(hào): CN102393379A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吁亭;高錚亞;余紹寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/35
• 分類號(hào): G01N21/35;G01N1/38
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于紅外光譜分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅外光譜測定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)是一類與生命相關(guān)的生物大分子，是生命體最重要的組成部分之一。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu),?不考慮側(cè)鏈的構(gòu)象及整個(gè)肽鏈的空間排列。常見的測定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法有X射線晶體衍射、核磁共振光譜、圓二色光譜、紫外光譜、熒光光譜與紅外光譜法等。

X射線晶體衍射是確定蛋白質(zhì)構(gòu)象最準(zhǔn)確的方法。雖然其能夠提供完整的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)信息,?但它要求高質(zhì)量的單晶樣品,?對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、柔性的生物大分子蛋白質(zhì)來說,?得到所需的晶體結(jié)構(gòu)較為困難。核磁共振(?NuclearMagnetic?Resonance,?簡稱NMR)?技術(shù)可以測定蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象,?但一般限于研究分子量不超過20?kD?的較小的蛋白,?而且對(duì)樣品的需求量大、純度要求高并且整個(gè)測定過程較慢,?因而也受到較大的限制。圓二色譜(?Circular?Dichroism,?簡稱CD)?法被廣泛地用于測定溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)和多肽構(gòu)象的研究,?但是只限于很窄的濃度范圍內(nèi)的澄清的溶液，且誤差很大。紫外和熒光光譜只限于測定蛋白質(zhì)分子中少數(shù)含有芳香族和雜環(huán)族的共軛環(huán)系統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)(?如Trp,?Try?,?Phe)。紅外光譜（Fourier?Transform?Infrared?Spectroscopic,簡稱FT-IR）?屬于分子振動(dòng)吸收光譜,?是化合物鑒定和結(jié)構(gòu)分析的常用手段。其獨(dú)特之處在于可以測定不同狀態(tài)、不同環(huán)境中的蛋白質(zhì)和多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此它是目前研究蛋白質(zhì)及多肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的有效手段之一。然而在水溶液情況下，要得到高質(zhì)量的紅外圖譜，一般要求蛋白質(zhì)的濃度很高（>12mg/ml）。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度下降時(shí)，紅外圖譜的質(zhì)量嚴(yán)重下降，特別是在對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象敏感的酰胺I帶。隨著噪音干擾的強(qiáng)度增加，二階導(dǎo)數(shù)的組成峰發(fā)生扭曲，這將直接影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算的準(zhǔn)確度。這一傳統(tǒng)方法對(duì)于蛋白質(zhì)濃度的要求使得紅外光譜在研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)受到限制，比如對(duì)疫苗的研究、對(duì)一些難溶性蛋白質(zhì)的研究等等。更為重要的是，由于熒光光譜和圓二色譜等技術(shù)研究蛋白質(zhì)時(shí)要求濃度很低，而傳統(tǒng)紅外光譜方法要求濃度很高，二者互相比較時(shí)就存在很大不確定性。因此建立一種測定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的紅外光譜方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、測試效率高的用紅外光譜測定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。

本發(fā)明提出的紅外光譜測定低濃度蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，采用蛋白質(zhì)分析紅外光譜儀，具體步驟如下：

1、制備氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物，具體步驟為：

a.?質(zhì)量濃度為2%?氫氧化鋁膠體和蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的緩沖液（如50?mM?Tris，PH?7.8，100?mM?KCl，1?mM?EDTA）按體積比為1:4-1:6混合，以低轉(zhuǎn)速4000-5000rpm（每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，revolutions?per?minute）離心2-3分鐘；?

b.?去除上清液，用緩沖液（如50?mM?Tris，PH?7.8，100?mM?KCl，1?mM?EDTA）將步驟a中得到的氫氧化鋁沉淀重懸至原濃度；

c.?將低濃度（為0.5mg/ml-1.5mg/ml）的蛋白質(zhì)和步驟b中所得的氫氧化鋁膠體按體積1:8-1:12混合，搖勻后放置室溫孵化30-40分鐘；

d.?將步驟c中所得的混合物以轉(zhuǎn)速4000-5000rpm離心2-3分鐘，去除上清液；

2、收集譜圖：將由緩沖液洗過的的氫氧化鋁膠體均勻的鋪滿蛋白質(zhì)分析紅外光譜儀的6.5um固定光程的CaF₂樣品池，使用Prota數(shù)據(jù)處理軟件收集背景光譜；在相同條件下，將氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物均勻的鋪滿CaF₂樣品池，調(diào)節(jié)固定樣品池，使得和背景的光程一樣，收集樣品的紅外光譜圖；

3、譜圖處理：使用Prota數(shù)據(jù)處理軟件，將氫氧化鋁-蛋白質(zhì)復(fù)合物的紅外圖譜扣除氫氧化鋁膠體的背景圖譜；位于2000?cm^-1-1750?cm^-1間呈一條光滑直線作為背景扣除與否的標(biāo)志；使用Prota軟件中Savitsky-Golay求導(dǎo)功能對(duì)蛋白質(zhì)吸收光譜進(jìn)行二次求導(dǎo)，獲得二級(jí)導(dǎo)數(shù)譜，并作基線修正。。