[發(fā)明專利]一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110353111.7
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102505008A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李冰;董守利;李琳;鐘南京;李曉璽;陳玲;蘇健裕
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C08L5/08;C08K3/22
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬;裘暉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

脂肪酶(lipase)即三酰基甘油酰基水解酶，其功能為催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶的基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈，其催化活性決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。天然的脂肪酶存在穩(wěn)定性差、易失活、無法重復(fù)利用，反應(yīng)后混入產(chǎn)品中，造成產(chǎn)物難分離、純度低、純化困難等問題，將其工業(yè)化生產(chǎn)仍存在著較大困難。研究發(fā)現(xiàn)，磁性固定化脂肪酶具有能回收、可反復(fù)使用、操作生能好、產(chǎn)物易分離、適用于大規(guī)格酶解反應(yīng)器等優(yōu)點，在生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用潛力。但是，磁性固定化脂肪酶活相對于游離酶要低，這是由于：①所固定的酶蛋白的分子狀態(tài)都是游離狀態(tài)或自然狀態(tài)，游離狀態(tài)或自然狀態(tài)的酶分子在固定化過程與磁性固定化載體作用容易失活，有時固定化酶的相對酶活僅為10％(相對酶活＝固定化酶的酶活/所用游離酶的酶活*100％)；②磁性固定化載體對酶的“活力稀釋”(dilution?of?activity)作用，即單位質(zhì)量固定化酶中酶的量大大減少了。針對這些問題，目前主要的改善措施包括：通過優(yōu)化固定化條件來減少游離酶的失活，從而提高磁性固定化酶的活性；或者，采用納米級的磁性載體，增加比表面積，提高單位質(zhì)量固定化酶中酶的量。

近十年間，出現(xiàn)一種嶄新的交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)技術(shù)，它是一種用鹽、有機(jī)溶劑或非離子型聚合物等沉淀酶蛋白制備酶聚集體，再用雙功能試劑對聚集體進(jìn)行交聯(lián)制備交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)的方法。與游離酶相比，CLEAs技術(shù)獲得的交聯(lián)酶聚集體穩(wěn)定性好、活性高，活性甚至可提高10倍以上。Cao等用非離子多聚體PEG沉淀青霉素G酰化酶，后通過戊二醛交聯(lián)，所得的CLEAs活力幾乎達(dá)到原酶活的100％(Cao?L.Q.，Rantwijk?F.V.Cross-linked?enzyme?aggregates：A?simple?and?effective?method?for?the?immobilization?of?penicillin?acylase.Organic?Letters，2000，2(10)：1361-1364.)。Hubert等人采用PEG為淀沉劑制備的交聯(lián)蟲漆酶聚集體呈現(xiàn)“超酶活”，酶的活力可達(dá)到游離酶活力的130％(Hubert?Cabana，J.Peter?Jones，Spiros?N.Agathos.Preparation?and?characterization?of?cross-linked?laccase?aggregates?and?their?application?to?the?elimination?of?endocrine?disrupting?chemicals.Journal?of?Biotechnology，2007，132(1)：23-31.)。Sangeetha等人研究交聯(lián)枯草桿菌蛋白酶聚集體穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)酶聚集體表現(xiàn)更廣的pH、溫度適應(yīng)性(K.Sangeetha，T.Emilia，Abraham.Preparation?and?characterization?of?cross-linked?enzyme?aggregates(CLEA)of?Subtilisin?for?controlled?release?applications.International?Journal?of?Biological?Macromolecules，2008，43：314-319.)。但CLEAs的結(jié)構(gòu)相對而言比較疏散，其用于大規(guī)模酶反應(yīng)器的操作性能明顯差于磁性固定化酶。工業(yè)化大規(guī)模的酶反應(yīng)器為了讓底物與酶催化劑充分接觸，通常采用增加底物流體流動的措施，這樣CLEAs的結(jié)構(gòu)會被破壞，降低CLEAs的酶活。

如何獲得高酶活而操作性能好的磁性固化酶是酶生物催化工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵難題，是酶工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸問題。磁性固化酶技術(shù)和交聯(lián)酶聚集體技術(shù)是酶固定化的兩種新技術(shù)，研究者對這兩種技術(shù)都分別在進(jìn)行著不斷地改善與完善工作。但是，由于兩種技術(shù)的自身的限制，將兩種技術(shù)相結(jié)合的酶固定化技術(shù)未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，包含以下步驟：