[發明專利]一種磁性固定化交聯脂肪酶聚集體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201110353111.7
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102505008A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 李冰;董守利;李琳;鐘南京;李曉璽;陳玲;蘇健裕
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C08L5/08;C08K3/22
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬;裘暉

1.一種磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)活化的磁性殼聚糖復合微球的制備：用磷酸鹽緩沖液將磁性殼聚糖復合微球充分溶脹；接著加入戊二醛溶液進行活化，戊二醛的最終體積濃度為0.03～3.0％；

(2)磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備：將交聯脂肪酶聚集體置于磷酸鹽緩沖液中，充分振蕩，使交聯脂肪酶聚集體均勻分布在磷酸鹽緩沖液中；接著加入步驟(1)制備的活化的磁性固定化交聯脂肪酶聚集體，于400～1000r/min的攪拌速度下交聯5～10小時；將液體和固體分離，取固體，蒸餾水洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯脂肪酶聚集體。

2.根據權利要求1所述的磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于：所述的磷酸鹽緩沖液為濃度0.1～1.0mol/L、pH值5.8～9.0的磷酸鹽緩沖液。

3.根據權利要求1所述的磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述的磁性殼聚糖復合微球通過包含如下步驟的制備方法制備得到：

①將殼聚糖溶解在體積濃度為1.0～3.0％醋酸溶液中，得到均一透明的殼聚糖濃度為1.0～4.0％的膠體溶液；接著加入Fe₃O₄納米顆粒，Fe₃O₄納米顆粒的用量相當于前述膠體溶液中殼聚糖質量的1/4～1，超聲作用下分散10～40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用；

②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液；司班與吐溫按質量比2～4∶1配比，液體石蠟占液體石蠟油相溶液的質量百分比85～95％；

③將步驟①制備的磁性殼聚糖膠體溶液滴入在攪拌狀態下的液體石蠟油相溶液，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液按體積比1∶2～4配比；接著攪拌10～40min后加入戊二醛溶液，控制戊二醛最終濃度為體積百分比0.1～1.0％，繼續攪拌40～120分鐘，調節pH值為8～12，于60～80℃條件下反應60～120分鐘，最后經磁鐵吸附，洗滌，干燥，得到磁性殼聚糖復合微球。

4.根據權利要求3所述的磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于：步驟①中所述的Fe₃O₄納米顆粒的粒徑范圍為50～300nm；

步驟①中所述的超聲的頻率為20～40KHz；

步驟②中所述的司班為司班-80或司班-65；

步驟②中所述的吐溫為吐溫-80或吐溫-65；

步驟③中所述的洗滌為依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復洗滌；

步驟③中所述的干燥為真空干燥。

5.根據權利要求1所述的磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述的磷酸鹽緩沖液的用量為按每1g磁性殼聚糖復合微球配比20～50mL磷酸鹽緩沖液計算；

步驟(1)中所述的溶脹的時間為10～24小時；

步驟(1)中所述的戊二醛的用量為每10g磁性殼聚糖復合微球使用1.0～5.0mL戊二醛進行活化。

6.根據權利要求1所述的磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于：步驟(2)中所述的交聯脂肪酶聚集體為通過包含如下步驟的制備方法制備得到：

A、將脂肪酶凍干酶粉溶解于磷酸鹽緩沖液中制成濃度為10～100mg/mL酶液，往酶液中滴加有機溶劑進行沉淀，有機溶劑滴加完畢后于4～10℃下靜置0.5～4.0小時，使脂肪酶沉淀；

B、接著加入戊二醛溶液，控制戊二醛終濃度為體積百分比0.1～5.0％，于4～10℃下攪拌，使脂肪酶交聯2～5小時；將所得懸濁液的固體和液體分離，取固體，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，將固體進行真空冷凍干燥，得到交聯脂肪酶聚集體。

7.根據權利要求6所述的磁性固定化交聯脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于：步驟A中所述的有機溶劑為叔丁醇、丙酮或乙腈中的一種或至少兩種；

步驟A中所述的有機溶劑的濃度為質量濃度50～100％；

步驟A中所述的有機溶劑的用量為每1mL酶液配比3～30mL有機溶劑；

步驟B中所述的將所得懸濁液的固體和液體分離的方式為離心；

所述的磷酸鹽緩沖液為濃度0.1～1.0mol/L、pH值5.8～9.0的磷酸鹽緩沖液。