[發(fā)明專利]一種基于Caco-2細(xì)胞模型建立的中藥活性成分指紋圖譜質(zhì)控方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110352717.9
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102608241A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 涂瑤生
• 申請（專利權(quán)）人: 涂瑤生
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種中藥成分圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立方法，具體的說是，一種基于Caco-2細(xì)胞模型建立的中藥活性成分指紋圖譜質(zhì)控方法；屬于中藥分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

中藥配伍規(guī)律是中醫(yī)藥理論的精華之一。古人云“用藥如用兵”，而在中藥的配伍應(yīng)用中，藥對的使用更可謂獨(dú)具匠心，頗有特色。藥對是中藥最小配伍單位，是復(fù)方配伍中最基本、最常用的形式和核心部分，也是藥物上升到藥方的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是單味藥與方劑間的橋梁，既增強(qiáng)了藥物的作用，擴(kuò)大了藥物的治療范圍，又為中藥方劑的配伍奠定了基礎(chǔ)。

藥對中兩個單味藥配伍，或增強(qiáng)藥物功效，或減低藥物毒副作用。單味藥配伍后，其化學(xué)成分有何變化及其與單味藥的關(guān)系，即藥對化學(xué)，是復(fù)方化學(xué)的核心，值得深入研究。

中藥有效成分經(jīng)過代謝，其化學(xué)成分質(zhì)與量均發(fā)生變化，以有效成分中的化學(xué)物質(zhì)作為中藥質(zhì)量的指標(biāo)性成分，并不能準(zhǔn)確反映藥物藥理效應(yīng)與毒性大小，而作為藥物真正發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)的中藥活性成分可作為中藥質(zhì)量檢測的指標(biāo)，通過中藥代謝前后化學(xué)成分對比研究，探討中藥活性成分代謝規(guī)律，明確中藥藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，建立以活性成分為指標(biāo)的中藥質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種基于Caco-2細(xì)胞模型的中藥活性成分指紋圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立方法，該方法可操作性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信、可重復(fù)好。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：一種基于Caco-2細(xì)胞模型的中藥活性成分指紋圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立方法，該方法依次包括下述步驟：

1)制備藥物供試品

按質(zhì)量比1∶1、2∶1、6∶1稱取黃連和吳茱萸，加入圓底燒瓶中，第一次加樣品總質(zhì)量8倍量水，浸30min；第二、三次分別加藥品總質(zhì)量4倍量水，沸騰后計(jì)時，每次1h，合并三次水煎液，濃縮至干，置真空干燥箱中減壓干燥成粉，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

2)建立Caco2單層細(xì)胞模型

用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)；將長勢良好的細(xì)胞接種在Nunc插入式培養(yǎng)板上，種植密度為5×10⁴個細(xì)胞·mL^-1；在漿膜層A面和粘膜層B面分別加0.5mL及1.5mL的培養(yǎng)基放入37℃孵箱中孵育；前14d隔天換液，以后每天換液1次，培養(yǎng)約21d，測定跨膜電阻值，當(dāng)TEER＞1.5～2倍空白孔TEER值時，說明細(xì)胞達(dá)到匯合、分化形成單細(xì)胞層，用于實(shí)驗(yàn)；

3)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究

Caco-2細(xì)胞在Nunc插入式培養(yǎng)板上形成緊密完整的單細(xì)胞層后，各孔用HBSS液蕩洗細(xì)胞3次；然后每孔加入2mL?37℃HBSS液，置于空氣搖床上繼續(xù)孵育1h，除去細(xì)胞表面的附著物，棄去HBSS液；藥物用HBSS液稀釋至最大細(xì)胞無毒濃度。藥物從絨毛面?zhèn)戎粱酌鎮(zhèn)鹊霓D(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)操作為：于AP側(cè)加入0.5mL藥物，B面加2.0mLHBSS液；置于37℃轉(zhuǎn)速為50r·min^-1的空氣搖床上，分別于載藥后0，30，60，90，120，180min從B側(cè)收集接受液0.5mL，并立即加等量HBSS液；藥物從BL側(cè)至AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)則將藥物加入BL側(cè)，AP側(cè)加入空白的HBSS液，其它步驟同AP側(cè)至BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)操作；考察受試液中成分在細(xì)胞層的吸收表達(dá)情況，并計(jì)算能表達(dá)的成分和特征的吸收速率；

4)對跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)后的化學(xué)成分進(jìn)行HPLC檢測

5)建立中藥黃連吳茱萸有效成分的指紋圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

從色譜的整體性出發(fā)，比較所有測定和記錄的色譜圖，最后確定黃連、吳茱萸的19個峰為特征峰，組成其指紋圖譜。

上述的基于Caco-2細(xì)胞模型的中藥成分圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立方法，其特征在于，所述的微孔濾膜為0.45μm的微孔濾膜。

上述的基于Caco-2細(xì)胞模型的中藥成分圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。

上述的基于Caco-2細(xì)胞模型的中藥成分圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立方法，其特征在于，所述的Nunc插入式培養(yǎng)板上直徑為25mm，微孔直徑：0.4μm。

上述的基于Caco-2細(xì)胞模型的中藥成分圖譜質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立方法，其特征在于，所述的色譜條件：黃連生物堿色譜條件：色譜柱：Agilent?Extend?C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.3％磷酸0.2％三乙胺(B)；流速：0.7ml/min；檢測波長：268nm；柱溫：20℃；運(yùn)行時間：65min；后運(yùn)行時間：10min。