[發明專利]一種高效提取綿羊內臟組織蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110352210.3
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102443046A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 張雪梅;李文蓉;賀三剛;張寧;劉明軍
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術領域

?本發明涉及綿羊內臟組織蛋白的提取，將冰凍破碎勻漿法和漩渦混合法相結合，對綿羊內臟組織中的蛋白質進行高效提取，以綠色熒光蛋白基因表達驗證其重要的實用價值。

背景技術

動物內臟組織是多種生物活性物質合成、代謝的場所，內含多種蛋白質，經常被用來檢測生物活性物質以及某些蛋白的表達及其表達量。動物蛋白質在組織或細胞中一般以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有成千上萬種不同的蛋白質，其提取和純化是一項艱巨而復雜的任務；要從復雜的混合物中完全提取出某種動物蛋白質，尚無普遍適用的方法；但任何一種動物蛋白質都可以根據其物理、化學性質及生物學特性，通過實驗摸索，選擇一套合適的提純程序獲取高純度的蛋白質。?????

由于蛋白質種類很多，性質上的差異很大，即使是同類蛋白質，因選用材料不同，提取方法差別也很大，不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分離和提取；因此從動物組織中分離提取蛋白，建立快速、簡便、重復性好的方法十分必要。

根據文獻檢索：①Nihan?Burul-Bozkurt等在小鼠坐骨神經組織中加入裂解緩沖液（裂解液組成：20mM?Tris?HCl(pH?7.5)，1mM?EDTA，5mM?MgCl₂，5mM?DTT，1﹪SDS，1mM?PMSF和cocktail蛋白酶抑制劑）進行組織勻漿，4℃、14,000轉/分鐘離心20min，分離上清，SDS-PAGE和Western-Blot檢測芳香酶蛋白表達，在55?kD處檢測到清晰的目的蛋白帶。②專利號為CN?101252849A的《從結締組織中分離蛋白質的系統和方法》的發明，公開了從結締組織中分離肌肉蛋白質，通過包括肌肉組織和結締組織的動物組織置于水性溶劑中生成漿液，然后該漿液在低剪切力環境下加速，能夠從結締組織中分離肌肉蛋白質，但該方法操作復雜，技術要求高。③2007年吳燕燕、王劍河，李來好等在《食品科學》2007,28(7):245-248.發表的“羅非魚內臟蛋白酶超聲波提取工藝的研究”以羅非魚內臟為原料，用蒸餾水洗凈，按1:5(W/V)加入0.02mol/L的磷酸緩沖液，勻漿破碎?,?將勻漿后的樣品分別放置于4℃冰箱和超聲波儀中處理一段時間，取出，勻漿液在4℃?10000r/min離心30min，收集上清液為提取蛋白酶液。

本發明依據動物蛋白質的物理、化學性質及生物學特性，通過實驗，選擇一套合適的提純程序獲取高純度的蛋白質；即將冰凍破碎勻漿法和漩渦混合法相結合，對綿羊內臟組織中的蛋白質進行高效提取，并對其體內表達水平進行Western?blot免疫組化驗證，具有重要的科學實踐意義。

發明內容

本發明的目的在于：提供高效提取綿羊內臟組織蛋白的方法?，為綿羊內臟組織蛋白的提取和分析提供簡便、高效、快速的技術方法，具較強的實用性。

本發明目的是這樣實現的：一種高效提取綿羊內臟組織蛋白的方法，以綿羊肝、脾、肺、腎的內臟組織為樣品，按細胞破碎、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的步驟實施：

細胞破碎：稱取20-25mg樣品，剪成3mm×3mm的小塊，置于預冷的2mL離心管中，其樣品與裂解液的加量比為1:3-1:5；繼續加入直徑為4-5cm的無菌鋼珠，置于TissueLyser??LT儀器中勻漿，勻漿40-50秒即粉碎，取出鋼珠，置于冰盒中3分鐘，在漩渦振蕩器上渦旋10秒，再置于冰盒、再渦旋，反復6-8次，使其充分溶解；取勻漿液在4℃、14000轉/分鐘、離心25-30分鐘，取上清得蛋白提取物；其中LT儀器在使用前先置于-70℃冰箱預冷;

蛋白定量：以BSA為對照，選用BCA法，依據多功能酶標儀的檢測結果，制定標準曲線，以計算蛋白濃度將其定量；取定量蛋白100μg，加入等量2×上樣?buffer，用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白；

其中蛋白裂解液的配方：取9M尿素2.7克，質量體積比為4﹪3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0.2克，用高壓滅菌去離子水溶解，補至5ml，凍存于-20℃冰箱中，使用前在裂解液中加入體積比為4﹪的蛋白酶抑制劑；

其中2×上樣?buffer的配方：取20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH為8.0,?100mM二硫蘇糖醇，2％十二烷基磺酸鈉，20％丙三醇，0.016％溴酚藍，依次加入試劑瓶中完全溶解后使用;