[發明專利]一種高效提取綿羊內臟組織蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110352210.3
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102443046A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 張雪梅;李文蓉;賀三剛;張寧;劉明軍
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

1.一種高效提取綿羊內臟組織蛋白的方法，其特征在于：以綿羊肝、脾、肺、腎的內臟組織為樣品，按細胞破碎、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的步驟實施：

細胞破碎：稱取20-25mg樣品，剪成3mm×3mm的小塊，置于預冷的2mL離心管中，其樣品與裂解液的加量比為1:3-1:5；繼續加入直徑為4-5cm的無菌鋼珠，置于TissueLyser??LT儀器中勻漿，勻漿40-50秒即粉碎，取出鋼珠，置于冰盒中3分鐘，在漩渦振蕩器上渦旋10秒，再置于冰盒、再渦旋，反復6-8次，使其充分溶解；取勻漿液在4℃、14000轉/分鐘、離心25-30分鐘，取上清得蛋白提取物；其中LT儀器在使用前先置于-70℃冰箱預冷;

蛋白定量：以BSA為對照，選用BCA法，依據多功能酶標儀的檢測結果，制定標準曲線，以計算蛋白濃度將其定量；取定量蛋白100μg，加入等量2×上樣?buffer，用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白；

其中蛋白裂解液的配方：取9M尿素2.7克，質量體積比為4﹪3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0.2克，用高壓滅菌去離子水溶解，補至5ml，凍存于-20℃冰箱中，使用前在裂解液中加入體積比為4﹪的蛋白酶抑制劑；

其中2×上樣?buffer的配方：取20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH為8.0,?100mM二硫蘇糖醇，2％十二烷基磺酸鈉，20％丙三醇，0.016％溴酚藍，依次加入試劑瓶中完全溶解后使用;

其中電泳檢測蛋白：將凝膠放入電轉緩沖液中，用濕轉法100V轉印60?min，加入5％脫脂奶粉室溫封閉2?h，用一抗為GFP單抗1∶400稀釋，在4℃孵育12-14h，PBST洗滌5次，每次10?min，用二抗為IRDye??800CW標記的羊抗鼠IgG抗體1∶12000稀釋，室溫下孵育50?min，用PBST洗滌5次，每次10?min，再用PBS洗滌一次，采用Odyssey近紅外雙色激光掃描成像。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：PBS是1×PBS磷酸緩沖液的配方：NaCL?8g，?KCL?0.2?g，Na₂HPO_4??1.44?g，KH₂PO₄?0.24?g，加去離子水800ml，用HCL調pH值至7.4，定容至1L，高壓滅菌；PBST是在1×PBS磷酸緩沖液中加入體積比為0.05﹪的Tween?20。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：TissueLyser??LT儀器為德國QIAGEN公司生產；4％蛋白酶抑制劑由Roche公司生產；一抗為GFP單抗，購自北京天根生化科技有限公司；二抗為IRDye??800CW標記的羊抗鼠IgG抗體，由Odyssey公司生產；PBS是1×PBS磷酸緩沖液購自Sigma公司。