[發明專利]一種象耳豆根結線蟲單根結的檢測方法與應用

有效

• 申請號: 201110350480.0
• 申請日: 2011-11-08
• 公開（公告）號: CN102367484A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 廖金鈴;胡茂秀;卓侃
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種象耳豆根結線蟲的檢測方法與應用。

背景技術

植物根結線蟲(Meloidogyne)是植物根系專性內寄生物，分布遍及世界大部分地區。因其適應性強、傳播途徑多樣、可侵染多種植物，而成為世界性威脅農業生產的主要病原物，給農業生產者造成極大的經濟損失。我國根結線蟲種類繁多，分布廣泛，除常見的南方根結線蟲(M.incognita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、北方根結線蟲(M.hapla)和花生根結線蟲(M.arenaria)4種主要的根結線蟲外，近年來調查表明象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)在我國南方地區分布較廣，并且危害嚴重。

象耳豆根結線蟲是1983年報道于我國海南省儋州的一個新種，原始寄主是象耳豆樹。近年來研究發現該線蟲可以寄生豆科、茄科、葫蘆科中的多種經濟作物以及番石榴等熱帶水果，更為重要的是該線蟲還可以侵染攜帶Mi抗性基因的番茄、辣椒、煙草等。2008年，象耳豆根結線蟲首次在歐洲被報道。同年，EPPO報道在中國出口至歐洲的玫瑰花上截獲到該線蟲，EPPO對該線蟲進行風險評估，認為該線蟲對中歐地區作物存在較大的風險。值得關注的是，Karssen等在2008年確認瑪雅古根結線蟲(M.mayaguensis)是象耳豆根結線蟲的同種異名。瑪雅古根結線蟲在非洲、南北美洲及歐洲均有分布，可以寄生的寄主超過8科20種植物，是國際上公認的危害最大的根結線蟲之一。可見象耳豆根結線蟲已成為全球熱帶、亞熱帶地區作物的一個重要病原物，且可能影響到我國的國際貿易。

然而，常規鑒定方法很難對象耳豆根結線蟲進行準確鑒定，因為象耳豆根結線蟲的會陰花紋同南方根結線蟲的會陰花紋非常相似。分子鑒定基本可滿足象耳豆根結線蟲的檢測鑒定，但模板DNA均來自線蟲。因此，探索新的靈敏度高的引物、能夠直接對單個根結DNA進行穩定擴增從而實現對象耳豆根結線蟲快速檢測具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是針對現有象耳豆根結線蟲快速檢測技術的不足，提供一種新的象耳豆根結線蟲單根結的檢測方法。

本發明另一個目的是提供所述檢測方法的應用。

本發明的技術問題通過下述技術方案予以實現：

提供一種象耳豆根結線蟲單根結的檢測方法，通過優化的聚合酶鏈反應檢測象耳豆根結線蟲，包括以下步驟：

(1)設計和合成引物；

(2)培養根結線蟲，提取含有根結線蟲的單根結DNA；

(3)以含有根結線蟲的單根結DNA為模板進行PCR擴增反應；

(4)將PCR擴增反應反應產物進行脂糖電泳檢測。

步驟(1)所述引物是根據植物線蟲大亞基核糖體DNA(基因登錄號為：AF435803、AF435794、AY446970、JN005857、FN429017、GQ375158、EU364890、EU570214、AF435793、AF435802、FJ485651、DQ328713、HQ688681、EU130893和EU368591)的D2D3設計一對根結線蟲通用引物MF和MR；再根據根結線蟲mtDNA?COII和lrRNA基因(基因登錄號為：FJ159631、AY635612、GQ266686、GQ266685、AY446970、GQ870255、AY757882、GQ865513、HM161680、AY635609、AY757909、AY942848、AY942851和EU364883)間區域種間差異設計一對擴增象耳豆根結線蟲的特異性引物FMe和RMe。所述引物的核苷酸序列為：

MF：5’-GGGGATGTTTGAGGCAGATTTGT-3’；

MR：5’-AACCGCTTCGGACTTCCACCAG-3’；

FMe：5’-CATTCATTTATACCAATTTTAGTTGAGG-3’；

RMe：5’-CAATTATTGAATATTTTTTCCCAAACGA-3’。

步驟(2)所述提取含有根結線蟲的單根結DNA的步驟如下：

將單個根結放入加了45μl?50mM?NaOH的離心管中，用研磨杵搗碎后以最大速度水平振蕩3～5min，短暫離心后95℃水浴10min，然后加入5μl1M?Tris-HCl(pH值為8.0)，混勻，12,000g離心30s，直接進行下一步的PCR反應或-20℃保存備用。

步驟(3)所述擴增反應是以步驟(2)提取的DNA作為模板，采用雙重PCR法進行擴增。