[發明專利]一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法

有效

• 申請號: 201110350307.0
• 申請日: 2011-11-08
• 公開（公告）號: CN102382811A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 黃鳳洪;鄭明明;郭萍梅;李文林;鄧乾春;楊湄;黃慶德;劉昌盛;萬楚筠;鈕琰星
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 黃行軍

技術領域

本發明涉及一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，具體涉及一種通過溶膠-凝膠法改性的凹凸棒土對酶進行吸附固定化方法，用于提高酶的固定化穩定性與催化活性，屬催化材料與酶固定化技術領域。

背景技術

油脂酯交換反應是指油脂(包括各種天然的植物油、動物脂肪以及食品工業的廢油)與低碳醇、脂肪酸或/和脂肪酸酯、植物甾醇等在催化劑作用下進行的化學反應，是油脂及脂肪酸衍生物改性的重要手段之一，可制備出一系列高附加值化工產品或者保健產品，如脂肪酸低碳烷基酯(生物柴油)、甾醇酯、蔗糖酯等。常用的酯交換催化劑主要有甲醇鈉、乙醇鈉等烷氧基堿金屬化合物。這些化學催化劑易于工業化但容易腐蝕設備，且易產生副產物，還存在后處理復雜、易造成三廢污染環境等嚴重缺點。酶催化合成法條件溫和，避免了高溫產生的副反應，且產物容易分離純化，但是游離酶的穩定性和回收、重復使用問題仍制約著實際生產中的應用。

凹凸棒土是一種天然納米層鏈狀結構的含水富鎂硅酸鹽粘土礦物，在我國資源豐富。其表面和內部含有大量的硅羥基、鎂羥基、鋁羥基等羥基，易于進行表面改性。凹凸棒土結構內部含有大量的結構水、結晶水和吸附水。這一點對于作為酶載體，可為酶提供一定的水分，對保持酶完整的結構是非常具有優勢的。另一方面，凹凸棒土作為一種無機礦物，不僅價廉易得，而且具備了一般無機載體均具有的優點即機械強度高、熱穩定性好、抗有機溶劑、抗微生物腐蝕等。采用凹凸棒土作為固定化酶的載體報道尚不多見，專利200610039833.4公開了脂肪酶在凹凸棒土表面的吸附固定化，由于只采用了單一的物理吸附，脂肪酶在使用過程中容易逐漸脫落，造成固定化酶活性的下降。單良等采氨丙基硅烷改性的凹凸棒土結合戊二醛法對菠蘿蛋白酶進行了固定化，但是傳統的硅烷化修飾方法需要使用大量有毒的甲苯等有機溶劑，且反應溫度較高，制備過程不夠環保。此外，文獻報道疏水載體有利于提高固定化脂肪酶酯交換的催化活性，然而純粹的疏水材料(如辛基硅膠)在水溶液中無法浸潤，在固定化過程中會出現操作困難以及酶固定化不均勻的現象。采用溶膠-凝膠的方法對凹凸棒土進行表面修飾，使其具有疏水和離子交換雙重保留作用，既可以提高脂肪酶的吸附量和穩定性，又可以提高其轉酯化的催化活性，目前此方面的研究還沒有報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，該凹凸棒土固定化酶具有成本低廉，催化活性高、反復使用性能好、制備過程環保的特點。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于它包括如下步驟：

1)凹凸棒土的酸處理(凹凸棒土先經過酸處理，以除去金屬雜質，活化表面羥基)：按凹凸棒土：鹽酸溶液＝1g∶10mL，選取凹凸棒土和鹽酸溶液；其中鹽酸溶液濃度為4-6mol/L；

將凹凸棒土浸泡于鹽酸溶液中，浸泡時間10-20h(浸泡溫度25-50℃)，處理完畢后，用純水洗至中性，得到酸處理后的凹凸棒土；

2)凹凸棒土的表面化學改性：將酸處理后的凹凸棒土懸浮于反應溶劑中，得到濃度為20-50mg/mL的懸浮液；

按硅烷化試劑總量：反應溶劑＝30-50mmol∶1L，選取硅烷化試劑；其中，硅烷化試劑由硅烷偶聯劑A和硅烷偶聯劑B組成，硅烷偶聯劑A與硅烷偶聯劑B的摩爾比為1∶0.5-1∶2；

按催化劑的用量為反應溶劑體積的3％-6％，準備催化劑；

將硅烷化試劑和催化劑與上述懸浮液混合，得到混合物；混合物在40-60℃，氮氣保護下機械攪拌反應10-20h，機械攪拌速度為200-400rpm；反應結束后，采用離心分離出顆粒狀物，顆粒狀物用蒸餾水和甲醇交替清洗3-5次后(各清洗3-5次)，得到清洗后的顆粒狀物(另外，還可采用濃硝酸或H₂O₂將巰基氧化為磺酸根)；將清洗后的顆粒狀物真空干燥，得到化學改性的凹凸棒土顆粒；

3)脂肪酶在凹凸棒表面的固定化：按脂肪酶：pH?5.0-7.0的磷酸鹽緩沖溶液＝2-5mg∶1mL，將脂肪酶加入到20-100mmol、pH?5.0-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中進行酶的吸附固定，離心取上清液，得到脂肪酶溶液；