[發明專利]一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法

有效

• 申請號: 201110350307.0
• 申請日: 2011-11-08
• 公開（公告）號: CN102382811A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 黃鳳洪;鄭明明;郭萍梅;李文林;鄧乾春;楊湄;黃慶德;劉昌盛;萬楚筠;鈕琰星
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 黃行軍

1.一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于它包括如下步驟：

1)凹凸棒土的酸處理：按凹凸棒土∶鹽酸溶液＝1g∶10mL，選取凹凸棒土和鹽酸溶液；其中鹽酸溶液濃度為4-6mol/L；

將凹凸棒土浸泡于鹽酸溶液中，浸泡時間10-20h，處理完畢后，用純水洗至中性，得到酸處理后的凹凸棒土；

2)凹凸棒土的表面化學改性：將酸處理后的凹凸棒土懸浮于反應溶劑中，得到濃度為20-50mg/mL的懸浮液；

按硅烷化試劑總量∶反應溶劑＝30-50mmol∶1L，選取硅烷化試劑；其中，硅烷化試劑由硅烷偶聯劑A和硅烷偶聯劑B組成，硅烷偶聯劑A與硅烷偶聯劑B的摩爾比為1∶0.5-1∶2；

按催化劑的用量為反應溶劑體積的3％-6％，準備催化劑；

將硅烷化試劑和催化劑與上述懸浮液混合，得到混合物；混合物在40-60℃，氮氣保護下機械攪拌反應10-20h，機械攪拌速度為200-400rpm；反應結束后，采用離心分離出顆粒狀物，顆粒狀物用蒸餾水和甲醇交替清洗3-5次后，得到清洗后的顆粒狀物；將清洗后的顆粒狀物真空干燥，得到化學改性的凹凸棒土顆粒；

3)脂肪酶在凹凸棒表面的固定化：按脂肪酶∶pH?5.0-7.0的磷酸鹽緩沖溶液＝2-5mg∶1mL，將脂肪酶加入到20-100mmol、pH?5.0-7.0的磷酸鹽緩沖溶液中進行酶的吸附固定，得到脂肪酶溶液；

按化學改性的凹凸棒土顆粒∶脂肪酶溶液＝50-80mg∶1mL，選取化學改性的凹凸棒土顆粒和脂肪酶溶液；將化學改性的凹凸棒土顆粒置于脂肪酶溶液中機械攪拌，進行脂肪酶的固定化，反應溫度15-30℃，機械攪拌速度150-200rpm，反應時間2-6h，反應結束后，經蒸餾水清洗3-5次，用有機溶劑浸泡1-3h，離心分離后冷凍干燥，得到用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶。

2.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：步驟1)所述的凹凸棒土的粒徑為100-400目。

3.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：步驟2)所述的反應溶劑為乙醇或異丙醇。

4.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：步驟2)所述的硅烷偶聯劑A為異丁基三甲氧基硅烷、異丁基三乙氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷或辛基三乙氧基硅烷；硅烷偶聯劑B為巰丙基三甲氧基硅烷、巰丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷。

5.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：步驟2)所述的催化劑為25-28％的濃氨水。

6.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：步驟2)所述清洗后的顆粒狀物需要采用氧化劑進行處理，按清洗后的顆粒狀物∶氧化劑的配比＝20g-40g/100mL，選取清洗后的顆粒狀物和氧化劑；將清洗后的顆粒狀物置于氧化劑中，在30-40℃處理8-20h，然后用水清洗2-3次。

7.根據權利要求7所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：所述的氧化劑為濃硝酸或濃度為30wt％-50wt％的雙氧水。

8.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：固定化酶吸附完成后浸泡所需的有機溶劑為丙酮或異丙醇。

9.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：所述的脂肪酶，包括來源于動物的豬胰腺酶，或來源于微生物發酵的皺褶假絲酵母、解脂假絲酵母、南極假絲酵母、洋蔥假單胞菌脂肪酶或米根霉。

10.根據權利要求1所述的一種用于酯交換反應的凹凸棒土固定化酶的制備方法，其特征在于：步驟3)中吸附固定溫度為15-30℃，吸附固定時間為2-6h。