[發明專利]表達gp64基因的新型基因工程重組病毒的構建方法

無效

• 申請號: 201110349720.5
• 申請日: 2011-11-08
• 公開（公告）號: CN102382803A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 王華林;王曼麗;干盈盈;鄧菲;胡志紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/866;C12R1/93
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 王守仁

技術領域

本發明屬于生物殺蟲劑的遺傳改良領域，具體涉及一種在桿狀病毒組II核多角體病毒（group?II?NPV）中表達組I核多角體病毒（group?I?NPV）的囊膜糖蛋白基因gp64的構建方法。該表達組I核多角體病毒（group?I?NPV）毒株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中科院微生物研究所，100101）。保藏日期是2011年6月?24?日，保藏號為：CGMCC?No：4976。

背景技術

桿狀病毒的天然宿主大部分是農林業的害蟲。1973年，桿狀病毒被聯合國糧農組織和世界衛生組織推薦為化學農藥的理想替代品。目前，我國已有6種桿狀病毒殺蟲劑正式登記注冊。桿狀病毒對宿主昆蟲具有專一而強烈的致病性，能夠在環境中長期存活，對人、畜及其他脊椎動物安全無害，不污染環境，是理想的“生物農藥”。然而，桿狀病毒殺蟲速度較慢、殺蟲譜窄，嚴重阻礙其大規模應用。

在桿狀病毒出牙型病毒粒子（BV）囊膜的表面，存在許多由糖蛋白組成的刺突狀結構，它們在介導病毒與受體結合，膜融合及出芽等過程發揮關鍵作用。group?I?NPV?BV的主要囊膜糖蛋白為GP64，group?II?NPV?BV的主要囊膜糖蛋白是F蛋白。GP64和F蛋白均是低pH誘導的膜融合蛋白。研究表明，GP64比F蛋白具有更強大的膜融合能力，而含有GP64的group?I代表株?AcMNPV與含F蛋白的group?II代表株HearNPV相比，具有更廣的宿主域和更高的殺蟲活性。

上述桿狀病毒組II核多角體病毒（group?II?NPV）中表達組I核多角體病毒（group?I?NPV）囊膜糖蛋白gp64基因的序列表在文章末尾。該序列表摘自NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1403961，Gene?ID為：1403961）。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種表達gp64基因的新型基因工程重組病毒的構建方法，該方法操作簡單，所構建的重組病毒具有生物安全性，其在農業的害蟲防治方面具有廣泛的應用前景。

本發明解決其技術問題采用以下的技術方案：

本發明提供的表達gp64基因的新型基因工程重組病毒是在組II核多角體病毒的基因組中表達AcMNPV?GP64，其中AcMNPV是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒Autographa?californica?multiplenucleopolyhedrovirus的英文縮寫，GP64是AcMNPV的囊膜糖蛋白。

本發明通過對野生型棉鈴蟲核多角體病毒Helicoverpa?armigera?single?nucleopolyhedrovirus,?簡稱為HearNPV進行基因工程遺傳改良后得到。具體改良方法是：在HearNPV?bacmid?HaBacHz8的多角體蛋白基因（polh）位點，插入：由AcMNPV?p10基因啟動子pP10及冷杉毒蛾核多角體病毒Orgyia?pseudotsugata?multiple?nucleopolyhedrovirus，簡稱為OpMNPV的囊膜糖蛋白基因啟動子pOp166共同啟動的AcMNPV的gp64基因，以及由AcMNPV?多角體蛋白基因啟動子pAcPolh和HearNPV多角體蛋白基因啟動子pHaPolh共同啟動的HearNPV多角體蛋白基因，由此得到重組病毒。

重組病毒所表達的外源基因為AcMNPV的囊膜糖蛋白基因gp64以及與AcMNPV?GP64氨基酸一致性達到75%以上的同源基因，或者基因突變修飾的gp64衍生基因。

本發明提供的上述AcMNPV?GP64，其在改良基因組不含有gp64的桿狀病毒的殺蟲活性方面的用途。

本發明提供的表達gp64基因的新型基因工程重組病毒的構建方法，其包括以下步驟：